Den subretinale implantasjonen av retinalpigmentert epitel (RPE) er en av de mest lovende tilnærmingene for behandling av degenerative retinale sykdommer. Imidlertid er ytelsen til prekliniske studier på store øyedyrmodeller fortsatt utfordrende. Denne rapporten presenterer retningslinjer for subretinal transplantasjon av RPE på en cellebærer i minigriser.
Degenerative forstyrrelser i netthinnen (inkludert aldersrelatert makuladegenerasjon), som primært stammer fra eller innenfor retinalpigmentert epitel (RPE), fører til en progressiv disorganisering av retinalanatomien og forverring av visuell funksjon. Substitusjonen av skadede RPE-celler (RPE) med in vitro-dyrkede RPE-celler ved bruk av en subretinal cellebærer har vist potensial for å gjenopprette den anatomiske strukturen til de ytre retinale lagene og blir derfor studert videre. Her presenterer vi prinsippene for en kirurgisk teknikk som muliggjør effektiv subretinal transplantasjon av en cellebærer med dyrkede RPEer til minigriser. Operasjonene ble utført under generell anestesi og inkluderte en standard linsesparende tre-port pars plana vitrektomi (PPV), subretinal påføring av en balansert saltløsning (BSS), en 2,7 mm retinotomi, implantasjon av en nanofibrøs cellebærer i subretinalrommet gjennom en ytterligere 3,0 mm sklerotomi, væske-luftutveksling (FAX), silikonoljetamponade og lukking av alle sklerotomiene. Denne kirurgiske tilnærmingen ble brukt i 29 operasjoner (18 dyr) de siste 8 årene med en suksessrate på 93,1%. Anatomisk verifikasjon av operasjonsplasseringen ble utført med in vivo fundusavbildning (fundusfotografering og optisk koherenstomografi). De anbefalte kirurgiske trinnene for subretinal implantasjon av RPE på en bærer i minigrisøyne kan brukes i fremtidige prekliniske studier ved bruk av store øyedyrmodeller.
Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) regnes som hovedårsaken til sentralt synstap i utviklede land og er en av mange forhold relatert til retinalpigmentert epitel (RPE) dysfunksjon 1,2. RPE finnes på den basalt lokaliserte Bruchs membran (BM) og gir nødvendig vedlikehold for fotoreceptorene. Den progressive degenerasjonen av RPE-laget er et kjennetegn ved den tidlige atrofiske formen for AMD, og den følger også med utviklingen av den sene eksudative formen for AMD også. Til tross for mange fremskritt innen retinal sykdomsterapi, er utviklingen av en effektiv behandlingsmodalitet fortsatt utfordrende3. En av de lovende metodene er RPE-erstatning ved hjelp av et in vitro-dyrket RPE-lag. Denne behandlingen er assosiert med fremgang i stamcelleforskning ved bruk av human embryonal stamcelleavledet RPE (hESC-RPE) og indusert pluripotent stamcelleavledet RPE (iPSC-RPE) 3,4,5,6,7. I de senere år har mange forskningsgrupper fokusert på å utvikle ulike tilnærminger for RPE-erstatning med det opprinnelig aksepterte proof-of-concept 8,9,10,11,12,13,14,15. RPE-cellene (RPE) leveres vanligvis inn i det subretinale rommet i form av en cellesuspensjon, et selvbærende celleark eller et cellemonolag støttet av en kunstig bærer 3,16,17,18,19,20,21. Injeksjon av en cellesuspensjon er den enkleste metoden, men den kompromitterte tilstanden til BM kan ofte forhindre vedlegg av de transplanterte cellene. Dette kan resultere i feil apikobasal orientering av RPEene og manglende dannelse av et monolag22,23. Den største fordelen med de to andre metodene (dvs. et selvbærende celleark og et cellemonolag støttet av et kunstig substrat) er at cellene allerede er i en differensiert monolagstilstand når de implanteres direkte i subretinalrommet24.
Mange kirurgiske teknikker som beskriver levering av cellebærere i subretinalrommet har blitt publisert de siste årene 8,9,10,11,12,13,14,15. Disse studiene beskrev bruken av store øye dyremodeller, typer cellulære bærere, bruk av transplanterte cellulære kulturer, implantasjonsinstrumenter, samt kirurgiske teknikker, og forfatterne fokuserte hovedsakelig på resultatene av subretinal implantasjon. I 2015 rapporterte Popelka et al. bruken av en rammestøttet ultratynn elektrospunnet polymermembran for transplantasjon av RPE i svinekadaver øyne8. Den kirurgiske teknikken beskrevet her med subretinal implantasjon av cellebæreren tillot relativt presis håndtering av bæreren og enkel posisjonering av stillaset i subretinalrommet. Kozak et al. vurderte muligheten for leveringsteknikken til en transportør med en omtrentlig størrelse på 2 mm x 5 mm i svineøyne9. Den unike utformingen av cellebæreren tillot riktig plassering, og forhindret det cellulære monolaget i å brette seg og rynke6. Al-Nawaiseh et al. presenterte først detaljerte trinnvise retningslinjer for subretinal stillasimplantasjon hos kaniner25. Stanzel et al. publiserte deretter en lignende protokoll i 2019 for transplantasjon hos smågnagere, kaniner, griser og ikke-menneskelige primater26. Som tidligere publisert resulterte transplantasjon av et differensiert og polarisert RPE-monosjikt på en fast bærer i bedret overlevelse og bedre integrering av transplantatet sammenlignet med andre forløsningsteknikker (tilleggsfil 1)27.
Formålet med alle prekliniske dyrestudier utført in vivo er å avdekke de ulike aspektene ved kirurgisk transvitreal subretinal implantasjon av en cellebærer med fokus på prosedyren sikkerhet, overlevelse av de transplanterte cellene, vevsrespons på subretinale manøvrer og kortsiktige og langsiktige postoperative utfall. Bruken av svineøyne som en storøyet dyremodell har blitt rapportert å være relevant med tanke på omfanget av dataene som er innhentet, noe som kan være nyttig og potensielt anvendelig for mennesker10,11,14. Vår studie rapporterer den kirurgiske teknikken som brukes til in vivo subretinal implantasjon av en cellebærer i en storøyet dyremodell. Vi presenterer en detaljert beskrivelse av preoperative preparater, kirurgisk teknikk for subretinal cellebærerimplantasjon og postoperativ pleie av minigrisøynene basert på vår erfaring de siste 8 årene. Vi beskriver de grunnleggende kirurgiske prinsippene som kan brukes til in vivo eksperimentelle studier som involverer implantasjon av ulike typer celler og cellebærere.
Stor dyremodell
Den eksperimentelle flokken av Liběchov minipigs ble grunnlagt ved å importere fem dyr fra Hormel-stammen fra USA i 1967. Disse dyrene ble krysset for blodgruppestudier av svin med flere andre raser eller stammer: Landrace, Large White, Cornwall, vietnamesiske griser og miniatyrgriser av Göttingen opprinnelse28,29. Ved 5 måneders alder og ca. 20 kg kroppsvekt blir minigrisene kjønnsmodne. Overlevelsen av foreldrenes minigrisraser (Hormel og Göttingen) er rapportert å være 12-20 år. Den subretinale implantasjonen av cellebæreren retter seg mot den sentrale delen av netthinnen. Netthinnen av minipigs mangler en makula og fovea. Imidlertid har den regioner med høyt konsentrerte kjeglefotoreseptorer kalt området centralis og visuelle striper30,31. Disse områdene er ansvarlige for den høyeste synsstyrken.
Operasjonene ble utført av fire erfarne vitreoretinale kirurger med hjelp av en erfaren kirurgisk anleggsassistent (TA). Før in vivo-eksperimentene ble kirurgene utdannet og oppnådd spesiell kunnskap om minipig øyeanatomi, for eksempel med hensyn til det lavere forholdet mellom linse og glassvolum, den kortere aksiale lengden (15-19 mm), fraværet av Bowmans membran i hornhinnen, det mindre glassvolumet (2, 8-3, 2 ml), fraværet av makula og fovea, fraværet av ringrommet til Zinn, og den optiske skivediameteren (vertikal/horisontal: 1,5 mm/2,1 mm). I alle tilfeller ble operasjonen utført under generell anestesi i et spesielt organisert operasjonsrom med implementering av standard aseptiske og antiseptiske tiltak.
Den subretinale implantasjonen av RPE-celler med forskjellig opprinnelse er en svært lovende trend innen øyeforskning for behandling av retinale degenerative lidelser, som AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . Hovedideen med denne tilnærmingen er å erstatte de skadede RPEene med sunne RPEer dyrket ex vivo (tilleggsfil 1) 44,45,46,47,48. Bruken av cellebærere for å transplantere de dyrkede RPE-cellene representerer den mest fornuftige tilnærmingen, siden de porøse membranene opprettholder det polariserte RPE-cellelaget i riktig orientering med hensyn til det fotosensoriske laget.
Optimal dyremodell
Et kritisk skritt i å utvikle slike behandlingsmetoder er bruken av den optimale dyremodellen49. Tidligere har små og store dyremodeller blitt brukt, inkludert kaniner, hunder, griser og ikke-menneskelige primater 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. I denne artikkelen foreslår vi bruk av Liběchov minigris-modellen og beskriver de preoperative, kirurgiske og postoperative trinnene som muliggjør robuste transplantasjonseffekter. Liběchov minigris ble opprinnelig oppdrettet for rundt 20 år siden og har blitt hyppig brukt i biomedisinsk forskning innen nevrodegenerative sykdommer, som Parkinsons og Huntingtons sykdom29,50. Siden grisen har en relativt stor hjerne med blodtilførsel og immunologisk respons som ligner på mennesker, har den blitt brukt som dyremodell for allogene transplantasjonseksperimenter også51,52,53,54. Selv om netthinnen til minipigene ikke har en menneskelignende makula og fovea, inneholder den området centralis og visuelle striper, som er regioner i netthinnen med høy konsentrasjon av kjeglefotoreseptorer30. Den samme størrelsen som det menneskelige øye, tilstedeværelsen av en kegleberiket sentral retina, det velbeskrevne immunsystemet og tilstedeværelsen av metoder for å vurdere morfologien og funksjonen etter operasjonen er viktige argumenter for bruken av denne store dyremodellen i den presenterte studien.
Kirurgisk prosedyre
Så vidt vi vet, finnes det ingen standardiserte og allment aksepterte kirurgiske teknikker for vitreoretinal transplantasjon av RPE-celler på bærere. Et av hovedproblemene med celleutskiftningsterapi er den utfordrende kirurgiske teknikken som har risiko for intraoperative og postoperative komplikasjoner knyttet til retinal detachment, hypotoni, episkleral, choroidal og / eller retinal blødning og høy intraokulær turbulens, noe som kan føre til stillasskader. Postoperativt er det risiko for proliferativ vitreoretinopati, endoftalmitt, hypotoni, netthinneløsning og kataraktdannelse 4,10,13,14,15.
De første studiene på tilnærminger ved bruk av cellebærere ble utført i chinchilla bastard kaniner13,16,25. Selv om disse dyrene representerer en liten dyremodell, var resultatene som fokuserte på de tekniske aspektene ved operasjonen avgjørende for utviklingen av prosedyrene i store dyremodeller og er derfor oppsummert nedenfor.
En skreddersydd 23 G infusjonskanyle ble opprinnelig brukt med to sideporter for å omdirigere jetstrømmen, noe som bidro til å løse sammenbruddet av bleb og påfølgende retinal detachment13. I denne studien la vi ikke merke til noen slik kollaps av bleb. Den mulige årsaken til det kan være den større størrelsen på øyebollet og ytelsen til kjernevitrektomien med spart glasslegeme i periferien på kanyleinfusjonsstedet, noe som kan redusere kraften til den rettede jetstrømmen.
Vanskeligheter under utkastet av cellebæreren fra instrumentet var en annen intraoperativ hindring i smådyrmodellene, som ble kategorisert som “fanget med instrumentet”. I tillegg foreslo forfatterne at gjenværende glasslegeme på retinaloverflaten kunne forårsake et bakover “hopp” av bæreren ut av retinotomiåpningen etter implantasjon. Dette problemet kan løses med en enzymassistert vitrektomi, som muliggjør en jevn, kontinuerlig utstøting av cellebæreren i det subretinale rommet. I de fleste tilfeller flyttet forfatterne bæreren for å oppnå en fjernere plassering av implantatet vekk fra retinotomi. I vår kasusserie opplevde vi også en situasjon der cellebæreren forble festet til spissen av injektoren. Det ble imidlertid håndtert ved langsom og forsiktig manipulering av lysrøret og injektorspissen. Vi observerte ingen rester av glasslegemet på retinotomistedet i noen av våre tilfeller. Bruk av TA-assistert PPV i operasjonene kan foreslås som en metode for å redusere risikoen for restfestet glasslegeme. Flere farginger med TA kan være nødvendig for å fjerne det overliggende glasslegemet helt.
I en annen studie ble resultatene av subretinal implantasjon av humane RPE-stamceller dyrket som et polarisert cellulært monolag på en polyestermembran rapportert24. Under forsøkene ble den samme kirurgiske teknikken beskrevet tidligere brukt13, men en to-port PPV-tilnærming ble brukt. Til slutt ble en trinnvis protokoll for subretinal implantasjon av cellebærerkirurgi hos kaniner publisert senere25. Denne studien presenterer en svært detaljert og lett repeterbar beskrivelse av det kirurgiske inngrepet, inkludert preoperativ og postoperativ behandling, som også er basert på tidligere erfaringer.
Under bruk av store dyremodeller i etterfølgende studier ble ikke bare tekniske spørsmål adressert, men også spørsmål angående immunreaksjonen til de transplanterte cellene, samt cellebærerstørrelsesrelaterte problemer. En studie med cynomolgusaper (Macaca fascicularis) beskrev resultatene av subretinal implantasjon av humane stamcelleavledede RPE-monolag15. Alle dyrene gjennomgikk systemisk immunsuppresjon, som besto av sirolimus (startdose på 2 mg, daglig dose på 1 mg) og tetracyklin (7,5 mg/kg kroppsvekt) med start 7 dager før operasjonen og som varte i 3 måneder etter operasjonen. Den kirurgiske prosedyren ble utført i henhold til protokoller beskrevet tidligere24,25. Forfatterne brukte en 25 G tre-port PPV-tilnærming med lysekrone endo-belysning. Det er viktig at en TA-assistert PVD ble brukt til å utelukke gjenværende vitreoretinal adhesjon på bakre retina. Som et tillegg til den opprinnelig beskrevne prosedyren fjernet forfatterne verts-RPE-laget i området for fremtidig implantasjon ved hjelp av et 20 G skreddersydd utvidbart sløyfeinstrument.
I vår minigrisstudie brukte vi også systemisk immunsuppresjon. Imidlertid var typen immunosuppresjon forskjellig fra den som er beskrevet ovenfor. Vi administrerte en subkutan injeksjon av takrolimus-eluerende polymermikrosfærer som et depot i en dose på 0,25 mg/kg kroppsvekt for å hindre avstøtning av celletransplantat og inflammatoriske reaksjoner. Vi fjernet ikke RPE-cellelaget under operasjonen, da vårt primære mål var å analysere sikkerheten til prosedyren og levedyktigheten til de implanterte cellene, men ikke deres integrering i vertsnetthinnen.
Tidligere ble sikkerheten og gjennomførbarheten av subretinal implantasjon av et monolag av hESC-avledede RPEer på en sammenleggbar ikke-nedbrytbar maskestøttet submikron parylen-C-membran (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm tykk) vurdert hos 14 kvinnelige Yucatán minigriser10. Etter dyrking ble cellene sådd på en maskestøttet membran. Immunsuppresjon ble utført ved systemisk administrering av takrolimus (ingen regime og dosering indisert) og intravitreale injeksjoner av 0,7 mg av et deksametason implantat ved slutten av kirurgi. PPV ble utført med en 20 G tilnærming. Forfatterne brukte en intravitreal injeksjon av triamcinolonacetonid for bedre visualisering av glasslegemet. Den store sklerotomien var 2 mm til 3 mm stor. Etter subretinal injeksjon ble retina flatt med en midlertidig injeksjon av perfluorkarbonvæske. Etter væske-luftutvekslingen ble det utført en silikonoljetamponade (1000/5000 cSt). Postoperativ behandling inkluderte okulær påføring av deksametason / neomycin / polymyksin B salve 1 uke etter operasjonen. Forfatterne rapporterte en suksessrate på 91% (dvs. effektiv subretinal implantasjon og tilstrekkelige postoperative bildedata). I vår studie ble intravitreal injeksjon av TA-krystaller brukt intraoperativt og hovedsakelig for å visualisere glasslegemet. Den lokale immunsuppressive virkningen av dette legemidlet er imidlertid fortsatt uklar. De nanofibrøse cellebærerne som ble brukt i vår studie var 5,2 mm x 2,1 mm og 3,7 μm tykke, med porestørrelser på 0,4 μm. Under operasjonen utførte vi direkte faks i stedet for å injisere perfluorkarbonvæske. Vår kirurgiske suksessrate (93,1%) var konsistent med og litt bedre enn Koss et al.10.
Subretinal transplantasjon av fullt nedbrytbare cellebærere (stillas) for subretinal implantasjon ble først studert i 2019 i Yorkshiregriser 14. Studien var hovedsakelig fokusert på de biologisk nedbrytbare egenskapene til fibrinhydrogelimplantater. Forfatterne bemerket at den aggressive immunsuppresjonen som ble brukt på tamgrisene, kunne hemme en lokal inflammatorisk reaksjon som potensielt ble forårsaket under biologisk nedbrytning av fibrinhydrogelimplantatene. De spesifiserte imidlertid ikke hvilken immundempende behandling som ble brukt hos grisene. Under PPV utførte de en 3,6 mm lang sklerotomi for innsetting av subretinal implantasjonsenhet parallelt med og ca. 3,5 mm bakenfor limbus. I tillegg brukte de et pneumatisk drevet injeksjonssystem som tar sikte på å redusere ustabiliteten ved håndplassering forårsaket av fingermanipulering. I vår kasusserie var alle sklerotomiene 2,5 mm til 3,0 mm fra limbus. Den store sklerotomien for innsetting av injektoren var 3 mm lang. Implantasjonsinjektoren som ble brukt i vår studie, ble operert for hånd. Grundig cautery av pars plana i ciliary kroppen og et tilstrekkelig kutt inne i den store sklerotomi synes å være avgjørende for å unngå intraoperative komplikasjoner som iatrogen perifer retinal detachment, blødning og tap av implantatet.
Oppsummert beskriver vi bruken av Liběchov minigris-modellen for transplantasjon av RPE-celler på biologisk nedbrytbare bærere som et behandlingsalternativ for arvelige og ervervede retinale sykdommer. Likheter i øyeanatomi og fysiologi, samt med hensyn til immunsystemet, tillater oss å utvikle og forbedre kirurgiske teknikker og instrumentering for subretinal implantasjon av celler, som lett kan overføres til behandling av humane øyesykdommer. Det er viktig å sikre at operasjoner på minigriser utføres ved hjelp av samme instrumentering (inkludert implantasjonsleveringsverktøy) når de brukes i menneskelige operasjoner, og dermed lette anvendelsen av oppnådd erfaring og kunnskap til mennesker. Alternative storøyde dyremodeller med tilstedeværelse av et makulært område, som ikke-menneskelige primater, kan være nyttige for oppfølging og analyse av de anatomiske og funksjonelle endringene etter subretinal implantasjon i det sentrale retinalområdet. Den detaljerte beskrivelsen av preoperative, kirurgiske og postoperative prosedyrer vil være nyttig for fremtidige studier ved å øke effektiv og standardisert datagenerering.
The authors have nothing to disclose.
Prosjektet ble støttet av The Czech Science Foundation (prosjektnummer 18-04393S) og Norway Grants and Technology Agency of the Czech Republic (KAPPA-programmet, prosjektnummer TO01000107).
Technical equipment | |||
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10 | Mindray, Shenzhen, China | Wato Ex-65 | anesthesia machine |
R-Evolution CR | Optikon, Rome, Italy | R-Evolution CR | phacoemulsifier/vitrectome |
Green laser Merilas 532α | Meridian, Thun, Switzerland | Merilas 532α | ophthalmic green laser |
Microscope Hi-R NEO 900A | Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany) | Hi-R NEO 900A | ophthalmic surgery microscope |
Camera Sony PMW-10MD | Sony, Tokyo, Japan | PMW-10MD | full HD medical 2-piece |
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM | Volk, Mentor, OH, USA | MERLIN BIOM | BIOM |
Steam sterilizer | Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL | 3870 HSG | sterilizer |
iCam100 | Optovue, Fremont, CA, USA | iCAM100 | funduscamera |
iVue OCT100-2 | Optovue, Fremont, CA, USA | iVue OCT100-2 | OCT |
Microsurgical instruments and devices | |||
Cook Eye Speculum | Katena, New Jersey, US | K1-5403 | 15mm blades |
Ophthalmology surgical drape | Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA | 79304 | 132 x 142cm |
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1272.ED06 | |
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula | DORC, Zuidland, Netherlands | 1279.P | |
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up | Surgical Specialties Corporation, Reading, USA | 72-2761G | |
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1270.EXT | |
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe | BBraun, Melsungen, Germany | 4617022V | 3ml |
1ml soft-inject Tuberculin | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 5010.200V0 | 1ml |
8-0 Coated Vicryl | Ethicon, Puerto Rico, USA | J409G | |
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml | (FCI, Paris, France) | S5.7170 | 1000cSt |
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga | Synergetics, O'Fallon, USA | 10.24.23PIN | 23Ga |
Revolution DSP 23Ga ILM forceps | Alcon, Geneva, Switzerland | 706.44 | Griesharber revolution |
23ga Straight Laser Probe | Synergetics, O’Fallon, USA | 55.21.23 | |
FCI Protect 2.0% | FCI Ophthalmics, Paris, France | S5.9100 | viscoelastic |
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 1-501 | Curve |
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-100-1E | 0,3mm straigh |
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-504E | 6mm |
DK Needle Holder, Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 3-201 | 9mm straigh |
Medications and solutions | |||
Unitropic 1% gtt. | UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic | tropicamidum 10 mg/ml | eye drops |
Diprophos | Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands | betamethasonum 7 mg/ml | 1ml |
Alcon BSS Irrigation Solution | Alcon, Geneva, Switzerland | balance salt solution (BSS) | 500ml |
Betaisodona | Mundipharma, Cambridge, United Kingdom | povidon-Iodine 1g/10ml | 30ml |
Depo-medrol 120mg | Pfizer, New Yourk, USA | methylprednisolon | 5ml/200mg |
Shotapen | Virbac Carros Cedex, France | benzylpenicillin, dihydrostreptomycin | 250ml |
Flunixin a.u.v. | Norbrook, Newry, Northern Ireland | flunixinum 50,0 mg | 250ml |
Tramal 100MG/2ML | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadol | 2ml |
Zoletil 100 | Virbac Carros Cedex, France | tiletamine, zolazepam | 100mg |
Narkeran 10 | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | ketamin | 2ml |
Rometar 20mg/ml | Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic | xylazinum | 20mg |
Braunol 75mg/g | B.Braun medical, Prague, Czech republic | povidone iodine | 75mg/g |
Propofol 1% MCT/LCT | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland | propofol | 10mg/1ml |
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid | Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom | isoflurane | 100% |
Benoxi gtt. 4mg/1ml | Unimed pharma, Bratislava, Slovakia | oxybuprakaine | 10ml |
Neosynephrin POS 10% gtt. | Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland | fenylefrin chloride | 10ml |
Ophthalmo-framykoin 1X5GM | Zentiva a.s., Prague, Czech republic | bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate | 5mg |
Floxal ung. | Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany | ofloxacin | 0.30% |
Eficur inj. | Hipra, Amer, Spain | ceftiofurum hydrochloridum | 50mg / 1ml |
Draxxin | Zoetis Inc., New Jersey, USA | tulathromycinum | 100mg / 1ml |
Tramal | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadoli hydrochloridum | 100mg / 2ml |
Xylapan | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | xylazinum | 0.4 mg/kg |
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5% | Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA | Proparacaine hydrochlorid | 0.50% |
Prograf | Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA | Tacrolimus powder | 1mg |
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector | |||
Falcon Cell Culture Inserts | Corning Inc., Kenneburg, ME, USA | 353103 | |
TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 12604021 | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11320033 | |
Biolaminin 521 LN (LN521) | BioLamina, Sundbyberg, Sweden | LN521-02 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 35050061 | |
2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | J66742.0B | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA | P4333 | |
CRALBP | Novus Biologicals, Abingdon, UK | NB100-74392 | |
Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Germany | 21202 |