Øjenfjernelse hos levende zebrafisklarver for at undersøge innerveringsafhængig vækst og udvikling af det visuelle system

Summary

Artiklen forklarer, hvordan man kirurgisk fjerner øjne fra levende zebrafisklarver som det første skridt i retning af at undersøge, hvordan retinal input påvirker optisk tektumvækst og udvikling. Derudover giver artiklen information om larveanæstetisering, fiksering og hjernedissektion efterfulgt af immunohistokemi og konfokal billeddannelse.

Abstract

Zebrafisk udviser bemærkelsesværdig livslang vækst og regenerative evner. For eksempel understøtter specialiserede stamcellenicher etableret under embryogenese kontinuerlig vækst af hele det visuelle system, både i øjet og hjernen. Koordineret vækst mellem nethinden og det optiske tektum sikrer nøjagtig retinotopisk kortlægning, da nye neuroner tilføjes i øjnene og hjernen. For at imødegå, om retinale axoner giver afgørende information til regulering af tektal stamme og stamcelleadfærd såsom overlevelse, proliferation og / eller differentiering, er det nødvendigt at kunne sammenligne innerverede og denerverede tektale lobes inden for det samme dyr og på tværs af dyr.

Kirurgisk fjernelse af det ene øje fra levende larvezebrafisk efterfulgt af observation af det optiske tektum opnår dette mål. Den ledsagende video viser, hvordan man anæstetiserer larver, elektrolytisk skærper wolframnåle og bruger dem til at fjerne det ene øje. Det næste viser, hvordan man dissekerer hjerner fra faste zebrafisklarver. Endelig giver videoen et overblik over protokollen for immunhistokemi og en demonstration af, hvordan man monterer farvede embryoner i lavsmeltepunktsalgarose til mikroskopi.

Introduction

Målet med denne metode er at undersøge, hvordan retinal input påvirker væksten og udviklingen af det optiske tektum, det visuelle behandlingscenter i zebrafiskens hjerne. Ved at fjerne det ene øje og derefter sammenligne de to sider af det optiske tektum kan tektale ændringer inden for den samme prøve observeres og normaliseres, hvilket muliggør sammenligning på tværs af flere prøver. Moderne molekylære tilgange kombineret med denne teknik vil give indsigt i de mekanismer, der ligger til grund for visuel systemvækst og udvikling, samt aksonal degeneration og regenerering.

Sensoriske systemer – visuelle, auditive og somatosensoriske – indsamler information fra eksterne organer og videresender disse oplysninger til centralnervesystemet og genererer “kort” over den ydre verden på tværs af midterhjernen ^1,2. Vision er den dominerende sensoriske modalitet for næsten alle hvirveldyr, herunder mange fisk. Nethinden, det neurale væv i øjet, samler information med et neuronalt kredsløb, der primært består af fotoreceptorer, bipolære celler og retinale ganglionceller (RGC’er), nethindens projektionsneuroner. RGC’er har lange axoner, der finder vej over nethindens indre overflade til det optiske nervehoved, hvor de fascikulerer og rejser sammen gennem hjernen og i sidste ende slutter i det visuelle behandlingscenter i den dorsale midterhjerne. Denne struktur kaldes det optiske tektum hos fisk og andre ikke-pattedyrs hvirveldyr og er homologt med den overlegne colliculus hos pattedyr³.

Det optiske tectum er en bilateralt symmetrisk flerlags struktur i den dorsale midterhjerne. I zebrafisk og de fleste andre fisk modtager hver lap af det optiske tectum udelukkende visuelt input fra det kontralaterale øje, således at den venstre optiske nerve slutter i højre tektale lap og den højre optiske nerve slutter i venstre tektale lap⁴ (figur 1). Ligesom sin pattedyrs modstykke, den overlegne colliculus, integrerer det optiske tectum visuel information med andre sensoriske input, herunder audition og somatosensation, der styrer skift i visuel opmærksomhed og øjenbevægelser såsom saccader ^1,5,6. I modsætning til pattedyrets overlegne colliculus genererer det optiske tectum kontinuerligt nye neuroner og glia fra en specialiseret stamcelleniche nær de mediale og kaudale kanter af de tektale lobes kaldet den tektale proliferationszone⁷. Vedligeholdelse af proliferative forfædre i det optiske tektum og andre regioner i centralnervesystemet bidrager til dels til den bemærkelsesværdige regenerative kapacitet, der er dokumenteret i zebrafisk⁸.

Tidligere arbejde med at undersøge hjernen hos blinde eller enøjede fisk afslørede, at optisk tektumstørrelse er direkte proportional med mængden af retinal innervering, den modtager ^9,10,11. Hos voksne hulefisk, hvis øjne degenererer i tidlig embryogenese, er det optiske tektum mærkbart mindre end for nært beslægtede, seende overfladefisk⁹. Cave fisk øjendegeneration kan blokeres ved at erstatte den endogene linse med en linse fra en overfladefisk under embryogenese. Når disse enøjede hulefisk opdrættes til voksenalderen, indeholder den innerverede tektale lap ca. 10% flere celler end den ikke-innerverede tektale lap⁹. På samme måde var siden af tektumet med mere innervering større og indeholdt flere neuroner¹⁰ i larve killifish, der blev inkuberet med kemiske behandlinger for at generere øjne af forskellig størrelse inden for det samme individ. Beviser fra optiske nerveknusningsforsøg i voksne guldfisk indikerer, at innervering fremmer spredning, hvor tektal celleproliferation falder, når innervation blev forstyrret¹¹.

Ved at bekræfte og udvide disse klassiske undersøgelser giver flere nylige rapporter data, der tyder på, at spredning som reaktion på innervering moduleres, i det mindste delvist, af BDNF-TrkB-vejen^12,13. Mange åbne spørgsmål om optisk tektumvækst og -udvikling forbliver, herunder hvordan et udviklende sensorisk system håndterer skade og axondegeneration, hvilke cellulære og molekylære signaler der muliggør retinal input til at regulere optisk tektumvækst, hvornår disse mekanismer bliver aktive, og om innerveringsbundet proliferation og differentiering gør det muligt for nethinden og dets målvæv at koordinere vækstrater og sikre nøjagtig retinotopisk kortlægning. Derudover er der meget større spørgsmål om aktivitetsafhængig udvikling, der kan løses ved at forhøre zebrafiskens visuelle system med kirurgiske tilgange som den, der er beskrevet nedenfor.

For at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, hvormed neural aktivitet, specifikt fra visuelt input, ændrer celleoverlevelse og proliferation, sammenligner den beskrevne tilgang direkte innerverede og denervaterede tektale lobes (figur 1) inden for individuelle zebrafisklarver. Denne metode muliggør dokumentation af RGC axondegeneration i det optiske tectum og bekræftelse af, at antallet af mitotiske celler korrelerer med innervering.

Figur 1: Skitser af zebrafiskelarver før og efter ensidig øjenfjernelse. (A) Tegning af 5 dpf larver set under et dissekerende mikroskop. Hver larve er indlejret i agarose med lavt smeltepunkt og orienteret sideværts, før en wolframnål med en skarp, kroget spids bruges til at øse øjet ud mod op (venstre øje i dette eksempel). (B) Tegning af dorsal visning af en 9 dpf larve som følge af operationen afbildet i A. Kun tre stærkt skematiserede RGC-axoner fra højre øje er vist defascikulerende og forbinde med neuroner i venstre tektale lap. Forkortelser: dpf = dage efter befrugtning; dps = dage efter operationen; RGC = retinale ganglionceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

Metoderne i dette papir blev udført i overensstemmelse med retningslinjer og godkendelse af Institutional Animal Care and Use Committees of Reed College og University College London. Se materialetabellen for detaljer om zebrafiskestammer, der anvendes i denne undersøgelse. 1. Forbered materialer og værktøjer Lav løsninger. Lav embryomedium (E314) ved at fortynde en 60x stamme (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl<…

Representative Results

For at bekræfte, om øjenfjernelsen var fuldstændig og vurdere, hvordan det optiske tektum ændres, blev der udført operationer i Tg[atoh7:RFP]-stammen, som mærker alle RGC’er med en membranmålrettet RFP og dermed alle axoner, der projicerer fra nethinden og danner synsnerven24. Selvom det ikke er absolut nødvendigt at bruge denne stamme, muliggør det ligetil observation og visualisering af de optiske nerveterminini i den optiske tectum neuropil. Andre tilgange til mærkning af syn…

Discussion

De teknikker, der er beskrevet i dette papir, illustrerer en af mange tilgange til at studere hvirveldyrs visuelle systemudvikling i zebrafisk. Andre forskere har publiceret metoder til at dissekere den embryonale nethinde og udføre genekspressionsanalyser¹⁹ eller visualisere neuronal aktivitet i det optiske tektum³⁰. Dette papir giver en tilgang til at undersøge, hvordan differentiel retinal input kan påvirke celleadfærd i det optiske tektum.

<p class="jove_content…

Materials

Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps – Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.