Enlèvement des yeux chez les larves vivantes de poisson zèbre pour examiner la croissance et le développement du système visuel dépendants de l’innervation

Summary

L’article explique comment enlever chirurgicalement les yeux des larves vivantes de poisson zèbre comme première étape vers l’étude de la façon dont l’apport rétinien influence la croissance et le développement du tectum optique. En outre, l’article fournit des informations sur l’anesthésie larvaire, la fixation et la dissection cérébrale, suivies de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale.

Abstract

Les poissons-zèbres présentent une croissance et des capacités de régénération remarquables tout au long de la vie. Par exemple, les niches de cellules souches spécialisées établies au cours de l’embryogenèse favorisent la croissance continue de l’ensemble du système visuel, à la fois dans l’œil et le cerveau. La croissance coordonnée entre la rétine et le tectum optique assure une cartographie rétinotopique précise à mesure que de nouveaux neurones sont ajoutés dans les yeux et le cerveau. Pour déterminer si les axones rétiniens fournissent des informations cruciales pour réguler les comportements des cellules souches tectales et progénitrices tels que la survie, la prolifération et / ou la différenciation, il est nécessaire de pouvoir comparer les lobes tectaux innervés et dénervés chez le même animal et entre les animaux.

L’ablation chirurgicale d’un œil de poisson-zèbre larvaire vivant suivie de l’observation du tectum optique atteint cet objectif. La vidéo d’accompagnement montre comment anesthésier les larves, aiguiser électrolytiquement les aiguilles de tungstène et les utiliser pour enlever un œil. Il montre ensuite comment disséquer les cerveaux des larves de poisson zèbre fixes. Enfin, la vidéo donne un aperçu du protocole d’immunohistochimie et une démonstration de la façon de monter des embryons colorés dans l’agarose à faible point de fusion pour la microscopie.

Introduction

Le but de cette méthode est d’étudier comment l’entrée rétinienne influence la croissance et le développement du tectum optique, le centre de traitement visuel dans le cerveau du poisson-zèbre. En enlevant un œil, puis en comparant les deux côtés du tectum optique, les changements tectaux au sein du même spécimen peuvent être observés et normalisés, ce qui permet une comparaison entre plusieurs spécimens. Les approches moléculaires modernes combinées à cette technique permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la croissance et au développement du système visuel, ainsi qu’à la dégénérescence et à la régénération axonales.

Les systèmes sensoriels – visuels, auditifs et somatosensoriels – recueillent des informations à partir d’organes externes et transmettent ces informations au système nerveux central, générant des « cartes » du monde extérieur à travers le mésencéphale ^1,2. La vision est la modalité sensorielle dominante pour presque tous les vertébrés, y compris de nombreux poissons. La rétine, le tissu neural de l’œil, recueille des informations avec un circuit neuronal composé principalement de photorécepteurs, de cellules bipolaires et de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR), les neurones de projection de la rétine. Les RGC ont de longs axones qui se frayent un chemin à travers la surface interne de la rétine jusqu’à la tête du nerf optique, où ils fasciculent et voyagent ensemble à travers le cerveau, se terminant finalement dans le centre de traitement visuel dans le mésencéphale dorsal. Cette structure est appelée tectum optique chez les poissons et autres vertébrés non mammifères et est homologue au colliculus supérieur chez les mammifères³.

Le tectum optique est une structure multicouche à symétrie bilatérale dans le mésencéphale dorsal. Chez le poisson-zèbre et la plupart des autres poissons, chaque lobe du tectum optique reçoit une entrée visuelle provenant uniquement de l’œil controlatéral, de sorte que le nerf optique gauche se termine dans le lobe tectal droit et le nerf optique droit se termine dans le lobe tectal gauche⁴ (Figure 1). Comme son homologue mammifère, le colliculus supérieur, le tectum optique intègre l’information visuelle à d’autres entrées sensorielles, y compris l’audition et la somatosensation, contrôlant les changements dans l’attention visuelle et les mouvements oculaires tels que les saccades ^1,5,6. Cependant, contrairement au colliculus supérieur des mammifères, le tectum optique génère continuellement de nouveaux neurones et glies à partir d’une niche de cellules souches spécialisée près des bords médial et caudal des lobes tectaux appelée zone de prolifération tectale⁷. Le maintien des progéniteurs prolifératifs dans le tectum optique et d’autres régions du système nerveux central contribue, en partie, à la remarquable capacité de régénération documentée chez le poisson-zèbre⁸.

Des travaux antérieurs examinant le cerveau de poissons aveugles ou borgnes ont révélé que la taille du tectum optique est directement proportionnelle à la quantité d’innervation rétinienne qu’il reçoit ^9,10,11. Chez les poissons des cavernes adultes, dont les yeux dégénèrent au début de l’embryogenèse, le tectum optique est sensiblement plus petit que celui des poissons de surface observés^étroitement apparentés 9. La dégénérescence de l’œil de poisson des cavernes peut être bloquée en remplaçant la lentille endogène par une lentille d’un poisson de surface pendant l’embryogenèse. Lorsque ces poissons des cavernes borgnes sont élevés à l’âge adulte, le lobe tectal innervé contient environ 10% plus de cellules que le lobe tectal non innervé⁹. De même, chez les larves de killifish qui ont été incubées avec des traitements chimiques pour générer des yeux de différentes tailles au sein d’un même individu, le côté du tectum avec plus d’innervation était plus grand et contenait plus de neurones¹⁰. Les preuves provenant d’expériences d’écrasement du nerf optique chez des poissons rouges adultes indiquent que l’innervation favorise la prolifération, la prolifération des cellules tectales diminuant lorsque l’innervation est perturbée¹¹.

Confirmant et étendant ces études classiques, plusieurs rapports récents fournissent des données suggérant que la prolifération en réponse à l’innervation est modulée, au moins en partie, par la voie BDNF-TrkB^12,13. De nombreuses questions ouvertes sur la croissance et le développement du tectum optique demeurent, notamment comment un système sensoriel en développement fait face aux blessures et à la dégénérescence axonale, quels signaux cellulaires et moléculaires permettent à l’entrée rétinienne de réguler la croissance du tectum optique, quand ces mécanismes deviennent actifs, et si la prolifération et la différenciation liées à l’innervation permettent à la rétine et à son tissu cible de coordonner les taux de croissance et d’assurer une cartographie rétinotopique précise. En outre, il existe des questions beaucoup plus vastes sur le développement dépendant de l’activité qui peuvent être abordées en interrogeant le système visuel du poisson-zèbre avec des approches chirurgicales telles que celle décrite ci-dessous.

Pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’activité neuronale, en particulier à partir de l’entrée visuelle, modifie la survie et la prolifération cellulaires, l’approche décrite compare directement les lobes tectaux innervés et dénervés (Figure 1) chez les larves individuelles de poisson zèbre. Cette méthode permet de documenter la dégénérescence des axones RGC dans le tectum optique et de confirmer que le nombre de cellules mitotiques est en corrélation avec l’innervation.

Figure 1: Croquis de larves de poisson zèbre avant et après ablation unilatérale des yeux. (A) Dessin de 5 larves de dpf vues au microscope à dissection. Chaque larve est incrustée dans l’agarose à point de fusion bas et orientée latéralement avant qu’une aiguille en tungstène avec une pointe pointue et crochue ne soit utilisée pour arracher l’œil tourné vers le haut (œil gauche dans cet exemple). (B) Dessin de la vue dorsale d’une larve de 9 dpf résultant de la chirurgie décrite dans A. Seuls trois axones RGC hautement schématisés de l’œil droit sont montrés en train de défasciculer et de se connecter aux neurones du lobe tectal gauche. Abréviations : dpf = jours après la fécondation ; dps = jours après la chirurgie; RGC = cellules ganglionnaires rétiniennes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Les méthodes décrites dans le présent document ont été menées conformément aux lignes directrices et à l’approbation des comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux du Reed College et de l’University College London. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les souches de poisson zèbre utilisées dans cette étude. 1. Préparer le matériel et les outils Trouvez des solutions. Fabriquer un mili…

Representative Results

Pour confirmer si l’ablation des yeux était complète et évaluer comment le tectum optique change, des chirurgies ont été effectuées dans la souche Tg[atoh7:RFP], qui étiquette tous les RGC avec un APPEL d’offres ciblé sur la membrane et, par conséquent, tous les axones qui se projettent à partir de la rétine et forment le nerf optique24. Bien que l’utilisation de cette souche ne soit pas absolument nécessaire, elle permet une observation et une visualisation simples des …

Discussion

Les techniques décrites dans cet article illustrent l’une des nombreuses approches pour étudier le développement du système visuel des vertébrés chez le poisson-zèbre. D’autres chercheurs ont publié des méthodes pour disséquer la rétine embryonnaire et effectuer des analyses d’expression génique¹⁹ ou visualiser l’activité neuronale dans le tectum optique³⁰. Cet article fournit une approche pour explorer comment l’entrée rétinienne différentielle pe…

Materials

Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps – Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.