Øyefjerning i levende sebrafisk larver for å undersøke innervasjonsavhengig vekst og utvikling av det visuelle systemet

Summary

Artikkelen forklarer hvordan man kirurgisk fjerner øyne fra levende sebrafisk larver som det første skrittet mot å undersøke hvordan retinal input påvirker optisk tectum vekst og utvikling. I tillegg gir artikkelen informasjon om larvalbedøvelse, fiksering og hjernespredning, etterfulgt av immunhiistokjemi og konføderasjonsavbildning.

Abstract

Sebrafisk viser bemerkelsesverdig livslang vekst og regenerative evner. For eksempel støtter spesialiserte stamcellenisjer etablert under embryogenese kontinuerlig vekst av hele det visuelle systemet, både i øyet og hjernen. Koordinert vekst mellom netthinnen og det optiske tectum sikrer nøyaktig retinotopisk kartlegging etter hvert som nye nevroner tilsettes i øyne og hjerne. For å adressere om retinal aksoner gir avgjørende informasjon for regulering av tectal stamme og stamcelleoppførsel som overlevelse, spredning og / eller differensiering, er det nødvendig å kunne sammenligne innervated og denervated tectal lobes i samme dyr og på tvers av dyr.

Kirurgisk fjerning av ett øye fra levende larval sebrafisk etterfulgt av observasjon av det optiske tectum oppnår dette målet. Den medfølgende videoen demonstrerer hvordan man bedøver larver, elektrolytisk skjerper wolfram nåler, og bruker dem til å fjerne ett øye. Det neste viser hvordan å dissekere hjerner fra faste sebrafisk larver. Til slutt gir videoen en oversikt over protokollen for immunhistokjemi og en demonstrasjon av hvordan man monterer fargede embryoer i lavsmeltingspunkt agarose for mikroskopi.

Introduction

Målet med denne metoden er å undersøke hvordan retinal input påvirker veksten og utviklingen av det optiske tectum, det visuelle prosesseringssenteret i sebrafiskhjernen. Ved å fjerne ett øye og deretter sammenligne de to sidene av det optiske tectumet, kan tektalendringer i samme prøve observeres og normaliseres, noe som muliggjør sammenligning på tvers av flere prøver. Moderne molekylære tilnærminger kombinert med denne teknikken vil gi innsikt i mekanismene som ligger til grunn for visuell systemvekst og utvikling, samt axonal degenerasjon og regenerering.

Sensoriske systemer – visuelle, auditive og somatosensoriske – samler informasjon fra eksterne organer og videresender den informasjonen til sentralnervesystemet, og genererer “kart” over den ytre verden over midbrain ^1,2. Visjon er den dominerende sensoriske modaliteten for nesten alle vertebrater, inkludert mange fisk. Netthinnen, nevralt vev i øyet, samler informasjon med en nevronal krets som hovedsakelig består av fotoreseptorer, bipolare celler og netthinne ganglion celler (RGCs), projeksjon nevroner av netthinnen. RGCer har lange axoner som finner veien over den indre overflaten av netthinnen til synsnerven hodet, hvor de fasciculate og reise sammen gjennom hjernen, til slutt avslutte i visuell behandling senter i dorsal midbrain. Denne strukturen kalles det optiske tectum i fisk og andre ikke-pattedyr vertebrater og er homolog til den overlegne colliculus hos pattedyr³.

Det optiske tectum er en bilateralt symmetrisk flerlagsstruktur i dorsal midbrain. I sebrafisk og de fleste andre fisk mottar hver lobe av det optiske tectum visuelle innspill utelukkende fra det kontralaterale øyet, slik at venstre optisk nerve slutter i høyre tectal lobe og høyre optisk nerve slutter i venstre tectal lobe⁴ (figur 1). Som sin pattedyr motpart, den overlegne colliculus, integrerer det optiske tectum visuell informasjon med andre sensoriske innganger, inkludert audition og somatosensasjon, kontrollerende skift i visuell oppmerksomhet og øyebevegelser som saccades ^1,5,6. Men i motsetning til pattedyrets overlegne colliculus, genererer det optiske tectum kontinuerlig nye nevroner og glia fra en spesialisert stamcellenisje nær de mediale og kaudale kantene på tektal lobes kalt tectal proliferation zone⁷. Vedlikehold av proliferative forfedre i det optiske tectum og andre regioner i sentralnervesystemet bidrar delvis til den bemerkelsesverdige regenerative kapasiteten dokumentert i sebrafisk⁸.

Tidligere arbeid med å undersøke hjernen til blinde eller enøyde fisk avslørte at optisk tectumstørrelse er direkte proporsjonal med mengden retinal innervering den mottar ^9,10,11. I voksenhulefisk, hvis øyne degener i tidlig embryogenese, er det optiske tectum merkbart mindre enn for nært beslektet, observert overflatefisk⁹. Cave fish eye degenerasjon kan blokkeres ved å erstatte den endogene linsen med en linse fra en overflatefisk under embryogenese. Når disse enøyde hulefiskene blir oppdrettet til voksen alder, inneholder den innerverte tectal lobe omtrent 10% flere celler enn den ikke-innerverte tectal lobe⁹. På samme måte, i larval killifish som ble inkubert med kjemiske behandlinger for å generere øyne av forskjellige størrelser i samme individ, var siden av tectum med mer innervasjon større og inneholdt flere nevroner¹⁰. Bevis fra optisk nerveknusing eksperimenter i voksen gullfisk indikerer at innervasjon fremmer spredning, med tectal celleproliferasjon avtagende når innervasjon ble forstyrret¹¹.

Ved å bekrefte og utvide disse klassiske studiene, gir flere nylige rapporter data som tyder på at spredning som svar på innervering er modulert, i hvert fall delvis, av BDNF-TrkB-banen^12,13. Mange åpne spørsmål om optisk tectum vekst og utvikling gjenstår, inkludert hvordan et utviklende sensorisk system håndterer skade og axon degenerasjon, hvilke cellulære og molekylære signaler som muliggjør retinal input for å regulere optisk tectum vekst, når disse mekanismene blir aktive, og om innervasjon-koblet spredning og differensiering gjør det mulig for netthinnen og målvevet å koordinere vekstrater og sikre nøyaktig retinotopisk kartlegging. I tillegg er det mye større spørsmål om aktivitetsavhengig utvikling som kan løses ved å forhøre sebrafiskens visuelle system med kirurgiske tilnærminger som den som er beskrevet nedenfor.

For å undersøke de cellulære og molekylære mekanismene som nevral aktivitet, spesielt fra visuell inngang, endrer celleoverlevelse og spredning, sammenligner den beskrevne tilnærmingen direkte innerverte og denerverte tektallober (figur 1) innenfor individuelle sebrafisk larver. Denne metoden tillater dokumentasjon av RGC axon degenerasjon i det optiske tectum og bekreftelse på at antall mititotiske celler korrelerer med innervasjon.

Figur 1: Skisser av sebrafisk larver før og etter ensidig øyefjerning. (A) Tegning av 5 dpf larver sett under et dissekerende mikroskop. Hver larve er innebygd i lavsmeltende punkt agarose og orientert lateralt før en wolfram nål med en skarp, hektet spiss brukes til å øse ut øyet vendt opp (venstre øye i dette eksemplet). (B) Tegning av dorsal utsikt over en 9 dpf larve som følge av operasjonen avbildet i A. Bare tre høyt skjemaerte RGC-axoner fra høyre øye vises defasciculating og tilkobling med nevroner i venstre tectal lobe. Forkortelser: dpf = dager etter befruktning; dps = dager etter operasjonen; RGC = retinal ganglion celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Metodene i denne artikkelen ble utført i samsvar med retningslinjer og godkjenning av Institutional Animal Care and Use Committees of Reed College og University College London. Se materialtabellen for detaljer om sebrafiskstammer som brukes i denne studien. 1. Forbered materialer og verktøy Lag løsninger. Lag embryomedium (E314) ved å fortynne en 60x lager (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl2-dihydrat …

Representative Results

For å bekrefte om øyefjerning var fullført og vurdere hvordan det optiske tectumet endres, ble det utført operasjoner i Tg[atoh7:RFP]-stammen, som merker alle RGCer med en membran-målrettet RFP og dermed alle aksoner som projiserer fra netthinnen og danner synsnerven24. Selv om det ikke er absolutt nødvendig å bruke denne stammen, muliggjør det enkel observasjon og visualisering av synsnerven termini i den optiske tectum neuropilen. Andre tilnærminger for merking av synsnerven, f…

Discussion

Teknikkene beskrevet i denne artikkelen illustrerer en av mange tilnærminger for å studere virveldyr visuell systemutvikling i sebrafisk. Andre forskere har publisert metoder for å dissekere den embryonale netthinnen og utføre genuttrykksanalyser¹⁹ eller visualisere nevronaktivitet i det optiske tectum³⁰. Dette dokumentet gir en tilnærming for å utforske hvordan differensial retinal input kan påvirke celleatferd i det optiske tectum.

For ?…

Materials

Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps – Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.