Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Summary

O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

Abstract

Os zebrafish exibem notável crescimento ao longo da vida e habilidades regenerativas. Por exemplo, nichos especializados de células-tronco estabelecidos durante a embriogênese suportam o crescimento contínuo de todo o sistema visual, tanto no olho quanto no cérebro. O crescimento coordenado entre a retina e o tectum óptico garante um mapeamento retinotópico preciso à medida que novos neurônios são adicionados nos olhos e no cérebro. Para abordar se os axônios da retina fornecem informações cruciais para a regulação de comportamentos tectal e células progenitoras, como sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação, é necessário ser capaz de comparar lóbulos tectal inervados e denervados dentro do mesmo animal e entre animais.

A remoção cirúrgica de um olho de zebrafish larval vivo seguida da observação do tectum óptico atinge esse objetivo. O vídeo que acompanha demonstra como anestesiar larvas, afiar eleticamente agulhas de tungstênio e usá-las para remover um olho. Em seguida, mostra como dissecar cérebros de larvas de zebrafish fixas. Finalmente, o vídeo fornece uma visão geral do protocolo de imunohistoquímica e uma demonstração de como montar embriões manchados em agarose de ponto de baixa fusão para microscopia.

Introduction

O objetivo deste método é investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico, o centro de processamento visual no cérebro de zebrafish. Removendo um olho e, em seguida, comparando os dois lados do tectum óptico, alterações tectal dentro do mesmo espécime podem ser observadas e normalizadas, permitindo a comparação entre vários espécimes. Abordagens moleculares modernas combinadas com esta técnica produzirão insights sobre os mecanismos subjacentes ao crescimento e desenvolvimento do sistema visual, bem como a degeneração e regeneração axonal.

Sistemas sensoriais – visuais, auditivos e somatosensoriais – coletam informações de órgãos externos e retransmitem essas informações para o sistema nervoso central, gerando “mapas” do mundo externo em todo o cérebro médio ^1,2. A visão é a modalidade sensorial dominante para quase todos os vertebrados, incluindo muitos peixes. A retina, o tecido neural no olho, reúne informações com um circuito neuronal composto principalmente por fotorreceptores, células bipolares e células gânglios da retina (RGCs), os neurônios de projeção da retina. Os RGCs têm longos axônios que encontram seu caminho através da superfície interna da retina até a cabeça do nervo óptico, onde eles fasciculam e viajam juntos através do cérebro, terminando no centro de processamento visual no cérebro dorsal. Esta estrutura é chamada de tectum óptico em peixes e outros vertebrados não-mamíferos e é homóloga ao colegiado superior em mamíferos³.

O tectum óptico é uma estrutura multicamadas bilateralmente simétrica no cérebro médio dorsal. Em zebrafish e na maioria dos outros peixes, cada lóbulo do tectum óptico recebe entrada visual apenas do olho contralateral, de modo que o nervo óptico esquerdo termina no lobo tectal direito e o nervo óptico direito termina no lobo tectal esquerdo⁴ (Figura 1). Assim como sua contraparte mamífera, o collículo superior, o tectum óptico integra informações visuais com outras entradas sensoriais, incluindo audição e somatosensação, controlando mudanças na atenção visual e movimentos oculares, como saccades ^1,5,6. No entanto, ao contrário do colículo superior mamífero, o tectum óptico gera continuamente novos neurônios e glia a partir de um nicho especializado de células-tronco perto das bordas medial e caudal dos lobos tectais chamado zona de proliferação tectal⁷. A manutenção de progenitores proliferativos no tecto óptico e em outras regiões do sistema nervoso central contribui, em parte, para a notável capacidade regenerativa documentada no zebrafish⁸.

Trabalhos anteriores examinando os cérebros de peixes cegos ou caolho revelaram que o tamanho do tectum óptico é diretamente proporcional à quantidade de inervação da retina que recebe ^9,10,11. Em peixes de cavernas adultos, cujos olhos degeneram em embriogênese precoce, o tectum óptico é visivelmente menor do que o de peixes de superfície^{9 intimamente} relacionados. A degeneração dos olhos dos peixes das cavernas pode ser bloqueada substituindo a lente endógena por uma lente de um peixe superficial durante a embriogênese. Quando esses peixes de caverna de um olho só são criados até a idade adulta, o lobo tectal inervatado contém aproximadamente 10% mais células do que o lobo tectal não inervado⁹. Da mesma forma, em killifish larval que foram incubados com tratamentos químicos para gerar olhos de diferentes tamanhos dentro do mesmo indivíduo, o lado do tectum com mais inervação foi maior e continha mais neurônios¹⁰. Evidências de experimentos de esmagamento de nervo óptico em peixes-dourados adultos indicam que a inervação promove a proliferação, com a proliferação de células tectais diminuindo quando a inervação foi interrompida¹¹.

Confirmando e ampliando esses estudos clássicos, vários relatórios recentes fornecem dados sugerindo que a proliferação em resposta à inervação é modulada, pelo menos em parte, pela via BDNF-TrkB^12,13. Muitas questões abertas sobre o crescimento e desenvolvimento do tectum óptico permanecem, incluindo como um sistema sensorial em desenvolvimento lida com lesões e degeneração do axônio, que os sinais celulares e moleculares permitem a entrada da retina para regular o crescimento do tectum óptico, quando esses mecanismos se tornam ativos, e se a proliferação e diferenciação ligadas à invasão permitem que a retina e seu tecido alvo coordenem as taxas de crescimento e garantam um mapeamento retinotópico preciso. Além disso, há questões muito maiores sobre o desenvolvimento dependente da atividade que podem ser abordadas interrogando o sistema visual de zebrafish com abordagens cirúrgicas como a descrita abaixo.

Para investigar os mecanismos celulares e moleculares pelos quais a atividade neural, especificamente a partir da entrada visual, altera a sobrevivência e a proliferação celular, a abordagem descrita compara diretamente os lobos tectal invatados e denervados (Figura 1) dentro de larvas individuais de zebrafish. Este método permite a documentação da degeneração do axônio RGC no tectum óptico e a confirmação de que o número de células mitóticas se correlaciona com a inervação.

Figura 1: Esboços de larvas de zebrafish antes e depois da remoção unilateral dos olhos. (A) Desenho de 5 larvas dpf vistas sob um microscópio dissecador. Cada larva é embutida em agarose de ponto de derretimento baixo e orientada lateralmente antes que uma agulha de tungstênio com uma ponta afiada e ligada seja usada para colher o olho voltado para cima (olho esquerdo neste exemplo). (B) Desenho da visão dorsal de uma larva de 9 dpf resultante da cirurgia retratada em A. Apenas três axônios RGC altamente esquematizados do olho direito são mostrados desfigurando e conectando-se com neurônios no lobo tectal esquerdo. Abreviaturas: dpf = dias pós fertilização; dps = dias após a cirurgia; RGC = células gânglios de retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Os métodos deste artigo foram conduzidos de acordo com as diretrizes e aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Reed College e university College London. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre as cepas de zebrafish utilizadas neste estudo. 1. Prepare materiais e ferramentas Faça soluções. Faça o embrião médio (E314) diluindo um estoque de 60x (300 mM NaCl, 10,2 mM…

Representative Results

Para confirmar se a remoção dos olhos foi completa e avaliar como o tectum óptico muda, foram realizadas cirurgias na cepa Tg[atoh7:RFP], que rotula todas as RGCs com um RFP direcionado à membrana e, assim, todos os axônios que projetam a partir da retina e formam o nervo óptico24. Embora o uso dessa cepa não seja absolutamente necessário, permite a observação e visualização direta do nervo óptico termini no neuropil tectum óptico. Outras abordagens para rotular o nervo ópt…

Discussion

As técnicas descritas neste artigo ilustram uma das muitas abordagens para estudar o desenvolvimento de sistemas visuais de vertebrados em zebrafish. Outros pesquisadores publicaram métodos para dissecar a retina embrionária e realizar análises de expressão genética¹⁹ ou visualizar a atividade neuronal no tectum^{óptico 30}. Este artigo fornece uma abordagem para explorar como a entrada diferencial da retina pode influenciar os comportamentos celulares no tectum óptico…

Materials

Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps – Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.