Ögonborttagning i levande zebrafisklarver för att undersöka innervationsberoende tillväxt och utveckling av det visuella systemet

Summary

Artikeln förklarar hur man kirurgiskt tar bort ögon från levande zebrafisklarver som det första steget mot att undersöka hur retinal inmatning påverkar optisk tektumtillväxt och utveckling. Dessutom ger artikeln information om larvbedövning, fixering och hjärndissektion, följt av immunohistokemi och konfokal avbildning.

Abstract

Zebrafisk uppvisar anmärkningsvärd livslång tillväxt och regenerativa förmågor. Till exempel stöder specialiserade stamcellsnischer som etablerats under embryogenes kontinuerlig tillväxt av hela det visuella systemet, både i ögat och hjärnan. Koordinerad tillväxt mellan näthinnan och det optiska tectum säkerställer noggrann retinotopisk kartläggning när nya neuroner läggs till i ögonen och hjärnan. För att ta itu med huruvida retinala axoner ger avgörande information för att reglera tektala stam- och stamcellsbeteenden som överlevnad, proliferation och / eller differentiering, är det nödvändigt att kunna jämföra innerverade och denerverade tektallober inom samma djur och över djur.

Kirurgiskt avlägsnande av ett öga från levande larvzebrafisk följt av observation av det optiska tectumet uppnår detta mål. Den medföljande videon visar hur man bedövar larver, elektrolytiskt skärper volframnålar och använder dem för att ta bort ett öga. Det visar sedan hur man dissekerar hjärnor från fasta zebrafisklarver. Slutligen ger videon en översikt över protokollet för immunohistokemi och en demonstration av hur man monterar färgade embryon i lågsmältpunktsagaros för mikroskopi.

Introduction

Målet med denna metod är att undersöka hur retinal inmatning påverkar tillväxten och utvecklingen av det optiska tectumet, det visuella bearbetningscentret i zebrafiskhjärnan. Genom att ta bort ett öga och sedan jämföra de två sidorna av det optiska tectumet kan tektala förändringar inom samma prov observeras och normaliseras, vilket möjliggör jämförelse över flera prover. Moderna molekylära tillvägagångssätt i kombination med denna teknik kommer att ge insikter i mekanismerna bakom visuell systemtillväxt och utveckling, liksom axonal degeneration och regenerering.

Sensoriska system – visuella, auditiva och somatosensoriska – samlar in information från yttre organ och vidarebefordrar den informationen till centrala nervsystemet och genererar “kartor” över den yttre världen över mitthjärnen ^1,2. Vision är den dominerande sensoriska modaliteten för nästan alla ryggradsdjur, inklusive många fiskar. Näthinnan, den neurala vävnaden i ögat, samlar information med en neuronal krets som huvudsakligen består av fotoreceptorer, bipolära celler och retinala ganglionceller (RGC), näthinnans projektionsneuroner. RGC har långa axoner som hittar sin väg över näthinnans inre yta till synnervshuvudet, där de fascikulaterar och reser tillsammans genom hjärnan och slutligen slutar i det visuella bearbetningscentret i dorsala mitthjärnan. Denna struktur kallas optisk tectum hos fisk och andra icke-däggdjursryggradsdjur och är homolog mot den överlägsna colliculus hos däggdjur³.

Det optiska tectumet är en bilateralt symmetrisk flerskiktad struktur i dorsala mitthjärna. Hos zebrafiskar och de flesta andra fiskar får varje lob i det optiska tektumet visuell inmatning enbart från det kontralaterala ögat, så att vänster synnerv slutar i höger tektallob och höger synnerv slutar i vänster tektallob⁴ (Figur 1). Liksom sin däggdjurs motsvarighet, den överlägsna colliculus, integrerar det optiska tectum visuell information med andra sensoriska ingångar, inklusive audition och somatosensation, som kontrollerar förändringar i visuell uppmärksamhet och ögonrörelser som saccades ^1,5,6. Men till skillnad från däggdjurets överlägsna colliculus genererar det optiska tectum kontinuerligt nya neuroner och glia från en specialiserad stamcellsnisch nära de mediala och kaudala kanterna på tektalloberna som kallas tectal proliferationszon⁷. Upprätthållande av proliferativa förfäder i det optiska tectumet och andra regioner i centrala nervsystemet bidrar delvis till den anmärkningsvärda regenerativa kapacitet som dokumenteras i zebrafisk⁸.

Tidigare arbete som undersökte hjärnorna hos blinda eller enögda fiskar avslöjade att optisk tektumstorlek är direkt proportionell mot mängden retinal innervation den får ^9,10,11. Hos vuxna grottfiskar, vars ögon degenererar i tidig embryogenes, är det optiska tektumet märkbart mindre än för närstående, synad ytfisk⁹. Grottfiskögondegeneration kan blockeras genom att ersätta den endogena linsen med en lins från en ytfisk under embryogenesen. När dessa enögda grottfiskar föds upp till vuxen ålder innehåller den innerverade tektalloben cirka 10% fler celler än den icke-innerverade tektalloben⁹. På samma sätt, i larvdödfisk som inkuberades med kemiska behandlingar för att generera ögon av olika storlekar inom samma individ, var sidan av tectum med mer innervation större och innehöll fler neuroner¹⁰. Bevis från optiska nervkrossexperiment hos vuxna guldfiskar indikerar att innervation främjar proliferation, med tektal cellproliferation som minskar när innervation stördes¹¹.

Bekräftar och utvidgar dessa klassiska studier, flera nya rapporter ger data som tyder på att proliferation som svar på innervation moduleras, åtminstone delvis, av BDNF-TrkB-vägen^12,13. Många öppna frågor om optisk tektumtillväxt och utveckling kvarstår, inklusive hur ett utvecklande sensoriskt system hanterar skada och axondegenerering, vilka cellulära och molekylära signaler möjliggör retinal ingång för att reglera optisk tektumtillväxt, när dessa mekanismer blir aktiva och om innervationskopplad proliferation och differentiering gör det möjligt för näthinnan och dess målvävnad att samordna tillväxthastigheter och säkerställa korrekt retinotopisk kartläggning. Dessutom finns det mycket större frågor om aktivitetsberoende utveckling som kan hanteras genom att förhöra zebrafiskens visuella system med kirurgiska tillvägagångssätt som den som beskrivs nedan.

För att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer genom vilka neural aktivitet, specifikt från visuell inmatning, förändrar cellöverlevnad och proliferation, jämför det beskrivna tillvägagångssättet direkt innerverade och denerverade tektallober (Figur 1) inom enskilda zebrafisklarver. Denna metod möjliggör dokumentation av RGC-axondegenerering i det optiska tektumet och bekräftelse på att antalet mitotiska celler korrelerar med innervation.

Figur 1: Skisser av zebrafisklarver före och efter ensidig ögonborttagning. (A) Ritning av 5 dpf larver sett under ett dissekerande mikroskop. Varje larv är inbäddad i lågsmältpunkt agaros och orienterad i sidled innan en volframnål med en skarp, krokad spets används för att skopa ut ögat uppåt (vänster öga i detta exempel). (B) Ritning av den dorsala vyn av en 9 dpf larv som härrör från den operation som avbildas i A. Endast tre mycket schematiserade RGC-axoner från höger öga visas defascikulerande och anslutande med neuroner i vänster tektallob. Förkortningar: dpf = dagar efter befruktning; dps = dagar efter operationen; RGC = retinala ganglionceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

Metoderna i detta dokument genomfördes i enlighet med riktlinjer och godkännande av Institutional Animal Care and Use Committees of Reed College och University College London. Se materialförteckningen för detaljer om zebrafiskstammar som används i denna studie. 1. Förbered material och verktyg Gör lösningar. Gör embryomedium (E314) genom att späda ut en 60x stam (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihydra…

Representative Results

För att bekräfta om ögonborttagningen var fullständig och bedöma hur det optiska tektumet förändras utfördes operationer i Tg [atoh7: RFP] -stammen, som märker alla RGC med en membranriktad RFP och därmed alla axoner som projicerar från näthinnan och bildar synnerven24. Även om det inte är absolut nödvändigt att använda denna stam, möjliggör den enkel observation och visualisering av synnervens termini i den optiska tectum neuropilen. Andra metoder för märkning av syn…

Discussion

De tekniker som beskrivs i denna uppsats illustrerar en av många metoder för att studera ryggradsdjurs visuella systemutveckling hos zebrafiskar. Andra forskare har publicerat metoder för att dissekera den embryonala näthinnan och utföra genuttrycksanalyser¹⁹ eller visualisera neuronal aktivitet i det optiska tectum³⁰. Detta dokument ger ett tillvägagångssätt för att utforska hur differentiell retinal inmatning kan påverka cellbeteenden i det optiska tectumet.

…

Materials

Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps – Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.