通过磁活化细胞分选在脱髓鞘动物模型中分离小鼠原代小胶质细胞
Summary
在这里，我们提出了一种方案，利用柱状磁激活细胞分选在脱髓鞘疾病的动物模型中分离和纯化原代小胶质细胞。
Abstract
小胶质细胞是大脑中常驻的先天免疫细胞，是中枢神经系统（CNS）炎症或损伤的主要反应者。小胶质细胞可分为静息状态和活化状态，并能响应大脑的微环境迅速改变状态。小胶质细胞将在不同的病理条件下被激活，并表现出不同的表型。此外，活化小胶质细胞有许多不同的亚群，不同亚群之间有很大的异质性。异质性主要取决于小胶质细胞的分子特异性。研究表明，小胶质细胞将被激活，并在炎症性脱髓鞘的病理过程中发挥重要作用。为了更好地了解小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病（如多发性硬化症和神经脊髓炎视谱系障碍）中的特征，我们提出了一种围膜原发性小胶质细胞分选方案。该方案利用柱状磁活化细胞分选（MACS）获得高度纯化的原代小胶质细胞，并保留小胶质细胞的分子特性，以研究小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病中的潜在作用。
Introduction
小胶质细胞起源于卵黄囊祖细胞，其很早就到达胚胎大脑并参与CNS1，2的发育。例如，它们参与突触修剪3 和调节轴突生长4。它们分泌促进神经元存活和帮助神经元定位的因子5。同时，它们参与去除异常细胞和凋亡细胞，以确保大脑的正常发育6。此外，作为大脑的免疫感受态细胞，小胶质细胞不断监测脑实质以清除死细胞，功能失调的突触和细胞碎片7。已经证明，小胶质细胞活化在多种疾病中起重要作用，包括炎症性脱髓鞘疾病，神经退行性疾病和脑肿瘤。多发性硬化症（MS）中活化的小胶质细胞有助于少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的分化和髓鞘的再生，通过吞噬髓鞘碎片8。
在阿尔茨海默病（AD）中，淀粉样蛋白β（Aβ）的积累激活小胶质细胞，其影响小胶质细胞9的吞噬和炎症功能。神经胶质瘤组织中活化的小胶质细胞，称为胶质瘤相关小胶质细胞（GAM），可以调节胶质瘤的进展并最终影响患者的预后10。激活深刻地改变了小胶质细胞转录组，导致形态学变化，免疫受体的表达，吞噬活性增加和细胞因子分泌增强11。在神经退行性疾病中，活化小胶质细胞有不同的亚群，例如疾病相关性小胶质细胞 （DAM）、活化反应小胶质细胞 （ARM） 和小胶质细胞神经退行性表型 （MGnD）8。
类似地，小胶质细胞的多个动态功能亚群也在炎症性脱髓鞘疾病中共存于大脑中12。了解小胶质细胞不同亚群之间的异质性对于研究炎症性脱髓鞘疾病的发病机制并找到其潜在的治疗策略至关重要。小胶质细胞的异质性主要取决于分子特异性8。准确描述小胶质细胞的分子改变对于研究异质性至关重要。单细胞RNA测序（RNA-seq）技术的进步使得在病理条件下鉴定活化小胶质细胞的分子特征13。因此，分离细胞群的能力对于在特定条件下进一步研究这些靶细胞至关重要。
为了解小胶质细胞的特征和功能而进行的研究通常是 体外 研究，因为已经发现可以从小鼠幼鼠大脑（1-3天大）制备和培养大量原代小胶质细胞，这些小鼠幼鼠附着在培养瓶上并与其他混合神经胶质细胞一起生长在塑料表面上。随后，纯小胶质细胞可以基于混合胶质细胞14，15的不同粘附性来分离。然而，这种方法只能从围产期大脑中分离出小胶质细胞，需要数周时间。细胞培养中的潜在变量可能会影响小胶质细胞特征，例如分子表达16。而且，通过这些方法分离的小胶质细胞只能通过模拟中枢神经系统疾病的状况来参与 体外 实验，不能代表小胶质细胞 在体内 疾病状态下的特征和功能。因此，有必要开发从成年小鼠大脑中分离小胶质细胞的方法。
荧光活化细胞分选（FACS）和磁分离是两种广泛使用的方法，尽管它们有其不同的局限性16，17，18，19。它们各自的优点和缺点将在讨论部分进行对比。MACS技术的成熟为快速纯化细胞提供了可能性。Huang等人已经开发出一种方便的方法来标记大脑中的脱髓鞘病变20。结合这两种技术方法，我们提出了一种快速有效的柱状CD11b磁分离方案，提供分步描述，以分离成年小鼠大脑脱髓鞘病变周围的小胶质细胞，并保留小胶质细胞的分子特征。局灶性脱髓鞘病变是由在开始方案21前3天在胼胝体中立体定向注射2μL溶血卵磷脂溶液（1%LPC在0.9%NaCl中）引起的。该协议为进行 体外 实验的下一步奠定了基础。此外，该协议节省了时间，并且在各种实验中广泛使用仍然是可行的。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方案提出了一种分离脱髓鞘病变周围的小胶质细胞的方法，可以帮助研究小胶质细胞在炎症性脱髓鞘疾病中的功能特征。使用CD11b珠捕获的小胶质细胞具有高纯度和活力。方案中的关键步骤包括病灶的精确定位和最佳的小胶质细胞纯化。在方案步骤2.1中，有必要在牺牲小鼠之前2小时注射NR溶液，以确保病变可以准确显示20。在方案步骤2.8中，注意将脑组织切片放在冰盒上进行解…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该研究得到了同济医院（HUST）优秀青年科学家基金会（No. 2020YQ06）的支持。
Materials
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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