Выделение первичной микроглии мыши методом магнитно-активированной сортировки клеток на животных моделях демиелинизации
Summary
Здесь мы представляем протокол для выделения и очистки первичной микроглии на животных моделях демиелинизирующих заболеваний с использованием столбчатой магнитно-активированной сортировки клеток.
Abstract
Микроглия, резидентные врожденные иммунные клетки в мозге, являются основными ответчиками на воспаление или травму в центральной нервной системе (ЦНС). Микроглия может быть разделена на состояние покоя и активированное состояние и может быстро менять состояние в ответ на микроокружение мозга. Микроглия будет активироваться при разных патологических состояниях и проявлять разные фенотипы. Кроме того, существует множество различных подгрупп активированной микроглии и большая неоднородность между различными подгруппами. Гетерогенность в основном зависит от молекулярной специфичности микроглии. Исследования выявили, что микроглия будет активироваться и играть важную роль в патологическом процессе воспалительной демиелинизации. Чтобы лучше понять характеристики микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях, таких как рассеянный склероз и расстройство зрительного спектра нейромиелита, мы предлагаем протокол перилезной первичной сортировки микроглии. Этот протокол использует столбчатую магнитно-активированную сортировку клеток (MACS) для получения высокоочищенной первичной микроглии и сохранения молекулярных характеристик микроглии для исследования потенциальных эффектов микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях.
Introduction
Микроглии происходят из желточно-мешочных прародителей, которые достигают эмбрионального мозга очень рано и участвуют в развитии ЦНС 1,2. Например, они участвуют в синаптической обрезке3 и регуляции роста аксонов4. Они выделяют факторы, которые способствуют выживанию нейронов и помогают локализации нейронов5. В то же время они участвуют в удалении аномальных клеток и апоптотических клеток для обеспечения нормального развития мозга6. Кроме того, как иммунокомпетентные клетки мозга, микроглия постоянно наблюдает за паренхимой мозга, чтобы очистить мертвые клетки, дисфункциональные синапсы и клеточный мусор7. Было продемонстрировано, что активация микроглии играет важную роль при различных заболеваниях, включая воспалительные демиелинизирующие заболевания, нейродегенеративные заболевания и опухоли головного мозга. Активированные микроглии при рассеянном склерозе (РС) способствуют дифференцировке клеток-предшественников олигодендроцитов (ОПК) и регенерации миелина путем поглощения миелиновых остатков8.
При болезни Альцгеймера (БА) накопление бета-амилоида (Aβ) активирует микроглию, которая влияет на фагоцитарные и воспалительные функции микроглии9. Активированная микроглия в ткани глиомы, называемая глиома-ассоциированной микроглией (GAM), может регулировать прогрессирование глиомы и в конечном итоге влиять на прогноз пациентов10. Активация глубоко изменяет транскриптом микроглии, что приводит к морфологическим изменениям, экспрессии иммунных рецепторов, повышению фагоцитарной активности и усилению секреции цитокинов11. Существуют различные подмножества активированной микроглии при нейродегенеративных заболеваниях, таких как ассоциированная с заболеванием микроглия (DAM), микроглия с активированным ответом (ARM) и микроглиальный нейродегенеративный фенотип (MGnD)8.
Аналогичным образом, множественные динамические функциональные подмножества микроглии также сосуществуют в головном мозге при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях12. Понимание неоднородности между различными подмножествами микроглии имеет важное значение для исследования патогенеза воспалительных демиелинизирующих заболеваний и поиска их потенциальных терапевтических стратегий. Гетерогенность микроглии в основном зависит от молекулярной специфичности8. Важно точно описать молекулярные изменения микроглии для изучения неоднородности. Достижения в технологии одноклеточного РНК-секвенирования (RNA-seq) позволили идентифицировать молекулярные характеристики активированной микроглии в патологических состояниях13. Поэтому способность изолировать клеточные популяции имеет решающее значение для дальнейшего исследования этих клеток-мишеней в определенных условиях.
Исследования, проводимые для понимания характеристик и функций микроглии, обычно являются исследованиями in vitro, поскольку было обнаружено, что большое количество первичной микроглии может быть получено и культивировано из мозга щенка мыши (1-3 дня), которые прикрепляются к колбам культуры и растут на пластиковой поверхности с другими смешанными глиальными клетками. Впоследствии чистую микроглию можно выделить на основе различной адгезивности смешанных глиальных клеток14,15. Однако этот метод позволяет изолировать микроглию только от перинатального мозга и занимает несколько недель. Потенциальные переменные в клеточной культуре могут влиять на характеристики микроглии, такие как молекулярная экспрессия16. Более того, микроглия, выделенная этими методами, может участвовать в экспериментах in vitro только путем моделирования состояний заболеваний ЦНС и не может представлять характеристики и функции микроглии в болезненных состояниях in vivo. Поэтому необходимо разработать методы выделения микроглии из мозга взрослой мыши.
Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) и магнитная сепарация являются двумя широко используемыми методами, хотя они имеют свои собственные различные ограничения 16,17,18,19. Их соответствующие преимущества и недостатки будут противопоставлены в разделе обсуждения. Созревание технологии MACS дает возможность быстрой очистки клеток. Huang et al. разработали удобный метод маркировки демиелинизирующих поражений в мозге20. Объединив эти два технических подхода, мы предлагаем быстрый и эффективный столбчатый протокол магнитного разделения CD11b, обеспечивающий пошаговое описание для выделения микроглии вокруг демиелинизирующих поражений в мозге взрослых мышей и сохранения молекулярных характеристик микроглии. Очаговые демиелинизирующие поражения были вызваны стереотаксическим введением 2 мкл раствора лизолецитина (1% LPC в 0,9% NaCl) в мозолистое тело за 3 дня до начала протокола21. Этот протокол закладывает основу для выполнения следующего шага в экспериментах in vitro. Более того, этот протокол экономит время и остается осуществимым для широкого использования в различных экспериментах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол предлагает метод выделения микроглии вокруг демиелинизирующих поражений, который может помочь изучить функциональные характеристики микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях. Микроглия, отловленная с помощью шариков CD11b, отличается высокой чистотой и жи…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было поддержано Фондом выдающихся молодых ученых больницы Тунцзи (HUST) (грант No 2020YQ06).
Materials
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
