Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.
Abstract
La microglía, las células inmunes innatas residentes en el cerebro, son las principales respuestas a la inflamación o lesión en el sistema nervioso central (SNC). La microglía se puede dividir en estado de reposo y estado activado y puede cambiar rápidamente de estado en respuesta al microambiente del cerebro. La microglía se activará bajo diferentes condiciones patológicas y exhibirá diferentes fenotipos. Además, hay muchos subgrupos diferentes de microglía activada y una gran heterogeneidad entre los diferentes subgrupos. La heterogeneidad depende principalmente de la especificidad molecular de la microglía. Los estudios han revelado que la microglía se activará y jugará un papel importante en el proceso patológico de la desmielinización inflamatoria. Para comprender mejor las características de la microglía en enfermedades inflamatorias desmielinizantes como la esclerosis múltiple y el trastorno del espectro de la neuromielitis óptica, proponemos un protocolo de clasificación microglial primaria perilesional. Este protocolo utiliza la clasificación de células activadas magnéticamente columnares (MACS) para obtener microglía primaria altamente purificada y preservar las características moleculares de la microglía para investigar los efectos potenciales de la microglía en enfermedades inflamatorias desmielinizantes.
Introduction
La microglía se origina a partir de progenitores de saco vitelino, que llegan al cerebro embrionario muy temprano y participan en el desarrollo del SNC 1,2. Por ejemplo, están involucrados en la poda sináptica3 y regulan el crecimiento axonal4. Secretan factores que promueven la supervivencia neuronal y ayudan a la localización neuronal5. Al mismo tiempo, están involucrados en la eliminación de células anormales y células apoptóticas para garantizar el desarrollo normal del cerebro6. Además, como las células inmunocompetentes del cerebro, la microglía vigila continuamente el parénquima cerebral para eliminar las células muertas, las sinapsis disfuncionales y los desechos celulares7. Se ha demostrado que la activación microglial juega un papel importante en una variedad de enfermedades, incluidas las enfermedades inflamatorias desmielinizantes, las enfermedades neurodegenerativas y los tumores cerebrales. La microglía activada en la esclerosis múltiple (EM) contribuye a la diferenciación de las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) y a la regeneración de la mielina al envolver los restos de mielina8.
En la enfermedad de Alzheimer (EA), la acumulación de beta amiloide (Aβ) activa la microglía, que afecta las funciones fagocíticas e inflamatorias de la microglía9. La microglía activada en el tejido del glioma, llamada microglía asociada al glioma (GAM), puede regular la progresión del glioma y, en última instancia, afectar el pronóstico de los pacientes10. La activación altera profundamente el transcriptoma microglial, lo que resulta en cambios morfológicos, expresión de receptores inmunes, aumento de la actividad fagocítica y aumento de la secreción de citoquinas11. Existen diferentes subconjuntos de microglía activada en enfermedades neurodegenerativas como la microglía asociada a la enfermedad (DAM), la microglía de respuesta activada (ARM) y el fenotipo neurodegenerativo microglial (MGnD)8.
Del mismo modo, múltiples subconjuntos funcionales dinámicos de microglia también coexisten en el cerebro en enfermedades desmielinizantes inflamatorias12. Comprender la heterogeneidad entre los diferentes subconjuntos de microglía es esencial para investigar la patogénesis de las enfermedades inflamatorias desmielinizantes y encontrar sus posibles estrategias terapéuticas. La heterogeneidad de la microglía depende principalmente de la especificidad molecular8. Es esencial describir con precisión las alteraciones moleculares de la microglía para el estudio de la heterogeneidad. Los avances en la tecnología de secuenciación de ARN unicelular (RNA-seq) han permitido identificar las características moleculares de la microglía activada en condiciones patológicas13. Por lo tanto, la capacidad de aislar poblaciones celulares es fundamental para una mayor investigación de estas células diana en condiciones específicas.
Los estudios realizados para comprender las características y funciones de la microglía suelen ser estudios in vitro, ya que se ha encontrado que se puede preparar y cultivar un gran número de microglía primaria a partir de cerebros de cachorros de ratón (1-3 días de edad), que se adhieren a los matraces de cultivo y crecen en la superficie plástica con otras células gliales mixtas. Posteriormente, la microglía pura se puede aislar en función de la diferente adhesividad de las células gliales mixtas14,15. Sin embargo, este método solo puede aislar la microglía del cerebro perinatal y toma varias semanas. Las variables potenciales en el cultivo celular pueden influir en las características microgliales como la expresión molecular16. Además, la microglía aislada por estos métodos solo puede participar en experimentos in vitro simulando las condiciones de las enfermedades del SNC y no puede representar las características y funciones de la microglía en estados de enfermedad in vivo. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos para aislar la microglía del cerebro del ratón adulto.
La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la separación magnética son dos métodos ampliamente utilizados, aunque tienen sus propias limitaciones diferentes 16,17,18,19. Sus respectivas ventajas y desventajas se contrastarán en la sección de discusión. La maduración de la tecnología MACS ofrece la posibilidad de purificar rápidamente las células. Huang et al. han desarrollado un método conveniente para etiquetar lesiones desmielinizantes en cerebros20. Combinando estos dos enfoques técnicos, proponemos un protocolo de separación magnética columnar CD11b rápido y eficiente, proporcionando una descripción paso a paso para aislar la microglía alrededor de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones adultos y preservar las características moleculares de la microglía. Las lesiones desmielinizantes focales fueron causadas por la inyección estereotáctica de 2 μL de solución de lisolecitina (1% LPC en NaCl al 0,9%) en el cuerpo calloso 3 días antes de iniciar el protocolo21. Este protocolo sienta las bases para realizar el siguiente paso en experimentos in vitro. Además, este protocolo ahorra tiempo y sigue siendo factible para su uso generalizado en varios experimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo propone un método para aislar la microglía alrededor de las lesiones desmielinizantes, que puede ayudar a estudiar las características funcionales de la microglía en las enfermedades inflamatorias desmielinizantes. La microglía capturada con perlas CD11b exhibe una alta pureza y viabilidad. Los pasos críticos en el protocolo incluyen la localización precisa de los focos y la purificación microglial óptima. En el paso de protocolo 2.1, es necesario inyectar la solución NR 2 h antes de sacrificar el …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por la Fundación para Jóvenes Científicos Excelentes del Hospital Tongji (HUST) (Subvención No. 2020YQ06).
Materials
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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