Ablation laser ciblée dans l’embryon de Saccharina latissima
Summary
La destruction de cellules spécifiques dans l’embryon est un outil puissant pour étudier les interactions cellulaires impliquées dans le destin cellulaire. Le présent protocole décrit les techniques d’ablation au laser de cellules ciblées dans l’embryon précoce de l’algue brune Saccharina latissima.
Abstract
Chez Saccharina latissima, l’embryon se développe sous la forme d’une feuille cellulaire monocouche appelée la lame ou lame. Chaque cellule embryonnaire est facile à observer, facilement reconnaissable de ses voisines et peut être ciblée individuellement. Pendant des décennies, l’ablation au laser a été utilisée pour étudier le développement embryonnaire. Ici, un protocole d’ablation au laser spécifique aux cellules a été développé pour les embryons précoces de l’algue brune S. latissima. Les travaux présentés comprennent: (1) la préparation d’embryons de Saccharina , avec une description des paramètres critiques, y compris les conditions de culture, (2) les paramètres d’ablation au laser, et (3) la surveillance de la croissance ultérieure de l’embryon irradié à l’aide de la microscopie time-lapse. En outre, des détails sont fournis sur les conditions optimales pour le transport des embryons de la plate-forme d’imagerie vers le laboratoire, ce qui peut affecter profondément le développement ultérieur des embryons. Les algues appartenant à l’ordre des Laminariales présentent des schémas d’embryogenèse similaires à saccharina; ce protocole peut ainsi être facilement transféré à d’autres espèces de ce taxon.
Introduction
L’ablation au laser est utilisée depuis des décennies pour étudier le développement embryonnaire. L’irradiation des cellules embryonnaires à l’aide d’un faisceau laser permet de surveiller le potentiel de régénération et la modification de la lignée cellulaire au cours de l’embryogenèse et d’étudier l’impact de l’ablation ciblée sur la division cellulaire et le devenir cellulaire. Les organismes modèles utilisés dans les méthodes d’ablation au laser sont généralement des animaux, tels que les insectes 1,2, les nématodes 3,4, les vertébrés 5,6 et parfois les plantes 7,8. De plus, une approche de micro-ablation au laser a été utilisée sur l’algue brune Fucus en 1994 et 1998 pour démontrer le rôle de la paroi cellulaire dans la photopolarisation de l’embryon précoce 9,10.
Les algues brunes appartiennent au groupe des Stramenopiles, qui ont divergé à la racine de l’arbre eucaryote il y a 1,6 milliard d’années. En conséquence, ils sont phylogénétiquement indépendants des autres organismes multicellulaires, tels que les animaux et les plantes11. Saccharina latissima appartient à l’ordre des Laminariales, plus communément appelés varechs, et ils sont parmi les plus grands organismes sur terre, atteignant des tailles de plus de 30 m. Saccharina sp. est une grande algue utilisée pour de nombreuses applications telles que l’alimentation humaine et animale, et ses polysaccharides sont extraits pour être utilisés dans les industries agricoles, pharmacologiques et cosmétiques du monde entier12, 13. Sa culture, principalement en Asie et plus récemment en Europe, nécessite la préparation d’embryons dans des écloseries avant de relâcher des juvéniles en pleine mer. Comme tous les varechs, il a un cycle de vie biphasique composé d’une phase gamétophytique microscopique, au cours de laquelle un gamétophyte haploïde se développe et produit des gamètes pour la fécondation, et d’une phase sporophytique macroscopique diploïde, où une grande lame plane se développe à partir de sa retenue attachée au fond marin ou aux rochers. Le sporophyte libère des spores haploïdes à maturité, complétant ainsi le cycle de vie 14,15,16.
S. latissima présente des caractéristiques morphologiques intéressantes17. Son embryon se développe sous la forme d’une feuille plane monocouche 15,18,19 avant d’acquérir une structure multicouche coïncidant avec l’émergence de différents types de tissus. De plus, Laminariales est l’un des seuls taxons d’algues brunes dont les embryons restent attachés à leur tissu gamétophyte maternel (Desmarestiales et Sporochnales en font trop15). Cette fonctionnalité offre l’occasion d’étudier le rôle du tissu maternel dans ce processus de développement et de comparer les mécanismes de contrôle maternel chez les algues brunes avec ceux des animaux et des plantes.
Cet article présente le premier protocole complet pour l’ablation au laser dans un embryon de varech précoce. Ce protocole impliquant la technique UV ns-pulsed entraîne la destruction spécifique de cellules embryonnaires individuelles pour étudier leurs rôles respectifs au cours de l’embryogenèse. La procédure offre une approche fiable pour étudier les interactions cellulaires et le devenir cellulaire au cours de l’embryogenèse chez les laminariales.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ablation laser cellulaire locale permet une ablation temporelle et spatiale avec un haut niveau de précision. Cependant, son efficacité peut être entravée par la non-accessibilité des cellules cibles; par exemple, toutes les cellules sont d’un embryon tridimensionnel. Ce protocole a été développé sur l’embryon de l’algue Saccharina latissima, qui développe une lame monocouche dans laquelle toutes les cellules peuvent être facilement distinguées et détruites individuellement avec un faiscea…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La bourse de doctorat de S.B. est financée par la Région Bretagne (numéro de subvention ARED COH20020) et la Sorbonne Université. I.T.is bourse de doctorat est financée par la Région Bretagne (numéro de subvention ARED COH18020) et l’Université norvégienne NMBU. Ce projet a reçu le soutien financier du CNRS à travers les programmes interdisciplinaires du MITI. MRic est membre de l’infrastructure nationale France-BioImagerie soutenue par l’Agence nationale de la recherche Français (ANR-10-INBS-04).
Materials
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | – | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | – | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. . The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology – Established and Emerging. , 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).
- Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
