Høyoppløselige kryo-EM-kart over makromolekyler kan også oppnås ved å bruke 200 kV TEM mikroskoper. Denne protokollen viser de beste fremgangsmåtene for å angi nøyaktige optikkjusteringer, datainnsamlingsordninger og valg av bildeområder som alle er avgjørende for vellykket innsamling av datasett med høy oppløsning ved hjelp av en 200 kV TEM.
Kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) har blitt etablert som en rutinemessig metode for proteinstrukturbestemmelse det siste tiåret, og tar en stadig økende andel av publiserte strukturelle data. Nylige fremskritt innen TEM-teknologi og automatisering har økt både hastigheten på datainnsamling og kvalitet på innsamvede bilder, samtidig som det reduserer det nødvendige kompetansenivået for å skaffe kryo-EM-kart ved sub-3 Å-oppløsninger. Mens de fleste av slike høyoppløselige strukturer er oppnådd ved hjelp av toppmoderne 300 kV cryo-TEM-systemer, kan høyoppløselige strukturer også oppnås med 200 kV cryo-TEM-systemer, spesielt når de er utstyrt med et energifilter. I tillegg reduserer automatisering av mikroskopjusteringer og datainnsamling med bildekvalitetsvurdering i sanntid systemkompleksiteten og sikrer optimale mikroskopinnstillinger, noe som resulterer i økt utbytte av bilder av høy kvalitet og generell gjennomstrømning av datainnsamling. Denne protokollen demonstrerer implementeringen av nyere teknologiske fremskritt og automatiseringsfunksjoner på et 200 kV kryooverføringselektronmikroskop og viser hvordan man samler inn data for rekonstruksjon av 3D-kart som er tilstrekkelig for de novo atommodellbygging. Vi fokuserer på beste praksis, kritiske variabler og vanlige problemer som må vurderes for å muliggjøre rutinemessig innsamling av slike høyoppløselige cryo-EM-datasett. Spesielt følgende viktige emner gjennomgås i detalj: i) automatisering av mikroskopjusteringer, ii) valg av egnede områder for datainnsamling, iii) optimale optiske parametere for innsamling av data av høy kvalitet, iv) energifilterjustering for nulltapsavbildning og v) datahåndtering og kvalitetsvurdering. Anvendelse av beste praksis og forbedring av oppnåelig oppløsning ved hjelp av et energifilter vil bli demonstrert på eksempelet på apo-ferritin som ble rekonstruert til 1,6 Å, og Thermoplasma acidophilum 20S proteasome rekonstruert til 2,1-Å oppløsning ved hjelp av en 200 kV TEM utstyrt med et energifilter og en direkte elektrondetektor.
Bestemmelse av proteinstruktur er avgjørende for å forstå molekylær arkitektur, funksjon og regulering av proteinkomplekser involvert i viktige cellulære prosesser, for eksempel cellemetabolisme, signaltransduksjon eller vertspatogeninteraksjoner. Kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) har dukket opp som en kraftig teknikk som er i stand til å løse 3D-strukturen til mange proteiner og deres komplekser som var for utfordrende for de tradisjonelle strukturelle teknikkene, for eksempel røntgendiffraksjon og NMR-spektroskopi. Spesielt har kryo-EM blitt bevist som den valgte metoden for membranproteiner, som ikke lett kan krystalliseres eller tilberedes i tilstrekkelige mengder for de tradisjonelle strukturelle teknikkene, og ga ny innsikt i strukturen og funksjonen til viktige cellulære reseptorer og ionkanaler 1,2,3,4,5 . Senest har cryo-EM spilt en viktig rolle i kampen mot Covid-19-pandemien ved å bestemme mekanismen for SARS-CoV-2-infeksjon på molekylært nivå, som belyste opprinnelsen til Covid-19 sykdom og ga grunnlag for rask utvikling av effektive vaksiner og terapeutiskestoffer 6,7,8,9,10.
Vanligvis brukes high-end 300-kV overføringselektronmikroskop (TEM) til høyoppløselig strukturbestemmelse av biomolekyler ved kryo-EM enpartikkelanalyse (SPA) for å avsløre deres konformasjon og interaksjoner. Nylig nådde SPA-teknikken en ny grense da den vanlige benchmark cryo-EM-prøven apo-ferritin ble rekonstruert ved atomoppløsning (1.2 Å)11,12 ved hjelp av en 300-kV TEM utstyrt med kaldt feltutslippspistol (E-CFEG), en direkte elektrondetektor og et energifilter. Ved denne resolusjonen var det mulig å entydig løse posisjoner av individuelle atomer i strukturen, konformasjon av individuelle aminosyresidekjeder samt hydrogenbinding og andre interaksjoner, som åpner nye muligheter for strukturbasert legemiddeloppdagelse av nye mål og optimalisering av eksisterende legemiddelkandidater.
Mellomtone 200 kV TEM mikroskoper brukes ofte til prøvescreening og prøveoptimalisering før endelig høyoppløselig datainnsamling ved hjelp av high-end TEM mikroskoper, spesielt på større cryo-EM-anlegg. Bildeprøver kan vanligvis løses i oppløsningsområdet 3-4 Å som er tilstrekkelig til å gå over til en avansert TEM på 300 kV for endelig datainnsamling. Derfor er datainnsamling ved hjelp av 200-kV TEM ofte ikke ytterligere optimalisert for høyest mulig oppløsningsresultater. Videre kan mange interessante biologiske spørsmål allerede besvares og publiseres ved disse resolusjonene, da alle aminosyre sidekjeder allerede er løst, og belegg av ligandbindingssteder kan også på en pålitelig måte bestemmes13. Det har allerede vist seg at 200 kV TEMs kan nå oppløsninger utover 3 Å for mange prøver 14,15,16,17,18. Bilder tatt ved 200 kV viser iboende høyere kontrast av avbildet partikler, noe som til og med kan lette mer nøyaktig innledende justering av partiklene til tross for mer svekket signal ved høy oppløsning sammenlignet med 300 kV TEM-bilder. Det er viktig å merke seg at den oppnådde oppløsningen av rekonstruerte kryo-EM-kart også er begrenset av strukturell fleksibilitet og konformasjons heterogenitet av avbildet prøver, som påvirker både 200-kV og 300-kV rekonstruksjoner. Faktisk ble mye mer kryo-EM-rekonstruksjoner oppnådd ved hjelp av 300 kV-systemene løst i 3-4 Å-oppløsningsområdet enn ved høyere oppløsninger19. Siden 200 kV TEM-mikroskoper er mindre komplekse og passer inn i mindre rom, representerer disse mikroskopene et godt, rimeligere alternativ for strukturbestemmelse av biologiske makromolekyler ved kryo-EM samtidig som automatisering av lange datainnsamlinger fra flere prøver som er lagret i mikroskopet Autoloader-systemet, bevares.
Innsamling av cryo-EM-datasett for høyoppløselig strukturbestemmelse krever nøyaktig justering av mikroskopoptikken. Kolonnejusteringer går systematisk fra elektronkilden ned til kondensatorlinsesystemet, objektivlinsen og energifilteret med en elektrondetektor. Den fullstendige sekvensen med justeringer er vanligvis ikke nødvendig. Ved behov styres brukeren via halvautomatiske prosedyrer med riktig beskrivelse av hvert trinn i et kontekstavhengig hjelpevindu gjennom justeringsprosedyren i mikroskopbrukergrensesnittet (Direct Alignments kontrollpanel). Når mikroskopet er fullstendig justert, forblir elektronoptikken stabil, og justeringene trenger ikke å endres i minst noen måneder. Bare de mest sensitive justeringene, for eksempel parallell belysning av prøveplanet, objektiv astigmatisme og komafri justering, må finjusteres like før innsamlingen av hvert datasett startes. Kvaliteten på innsamlede data kan deretter overvåkes under datainnsamling ved hjelp av forskjellige programvarepakker, for eksempel EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 eller Appion24.
I tillegg til nøyaktige justeringer av mikroskopet, er den høye kvaliteten på godt rensede prøver med minimal konformasjons- og komposisjonell heterogenitet også en forutsetning for innsamling av høyoppløselige datasett og løsning av høyoppløselige strukturer. Flere detaljer om typiske protokoller, hyppige utfordringer og mulige rettsmidler finner du i andre vurderinger dedikert til dette emnet 25,26,27. I hovedsak er det viktig å finne områder på et gitt kryo-EM-rutenett som har tilstrekkelig tynn is til å bevare høyoppløselig informasjon, og individuelle partikler er tett fordelt ved tilfeldige orienteringer uten overlappinger. Typiske kryo-EM-gitter har imidlertid ikke-ensartet istykkelse, og det er derfor viktig å finne og velge de optimale områdene for avbildning. Ulike måter for estimering av istykkelse på nettet er tilgjengelig i programvarepakker dedikert til automatisert innsamling av cryo-EM-datasett, for eksempel EPU 2, Leginon28 eller SerialEM29.
Fremveksten av raske og sensitive direkte elektrondetektorer gjorde det mulig å samle bilder i mange fraksjoner som filmer som muliggjorde kompensasjon av stråleinduserte bevegelser og resulterte i en betydelig økning i kvaliteten og mengden data som brukes i bildebehandling og endelig 3D-rekonstruksjon30. Samtidig gir automatisering og datainnsamling med høy gjennomstrømning enorme datasett med tusenvis av bilder/filmer som representerer utfordringer for datalagring og tilgang. Den vedtatte modellen med store cryo-EM-anlegg som betjener titalls til hundrevis av brukere, krever spesielt organisert datahåndtering med riktig sporing og datadeling i etablerte cryo-EM-rørledninger31,32.
Denne studien beskriver en protokoll for rutinemessig innsamling av høyoppløselige cryo-EM-datasett ved hjelp av 200 kV Glacios TEM mikroskop. Nødvendige justeringer av mikroskopoptikken er beskrevet sammen med prosedyrer for evaluering av kryo-EM-prøver og valg av egnede områder for datainnsamling med høy oppløsning. Organiseringen av innsamlede data og relaterte metadata med eksempelinformasjon er demonstrert i Athena – en datahåndteringsplattform som letter gjennomgangen av eksempelinformasjon og innsamlede data. Ved hjelp av musens apo-ferritinprøve var det mulig å oppnå en 3D-rekonstruksjon ved 1,6 Å resolusjon13. Ved hjelp av den beskrevne protokollen rekonstruerte vi også 3D-tetthetskartet over 20S-proteasomet fra Thermoplasma acidophilum ved 2,1 Å-oppløsning.
Den beskrevne protokollen forutsetter at optikken til det brukte TEM-mikroskopet er i en godt justert tilstand. For 200 kV TEM som brukes i denne protokollen, utføres, verifiseres og lagres slike kolonnejusteringer av en erfaren servicetekniker etter mikroskopinstallasjon eller betydelig tjenesteintervensjon. Disse justeringsinnstillingene kan tilbakekalles når som helst i mikroskopgrensesnittet. Brukere kan bruke direct alignment-prosedyrene i mikroskopgrensesnittet til å finjustere kritiske parametere på nytt. Noen justeringer, for eksempel pistolvinkel og pistolskift, er stabile og trenger ikke å justeres av brukere på daglig basis. Kontroller og om justeringer (om nødvendig) av pistolvinkel og skift av mikroskoplederen anbefales to ganger i året. På den annen side er noen justeringer kritiske og må justeres før hver datainnsamling som beskrevet i protokollen ovenfor (for eksempel objektiv astigmatisme og komafri justering). Hvis Autocoma-funksjonen i analyseprogramvaren ikke konvergerer, bør justering av strålevinkel dreiepunkter og / eller rotasjonssenter verifiseres og justeres, og riktig sentrering av C2-blenderåpningen bør bekreftes. Etterpå bør Autostigmate-funksjonen kjøres som objektive stigmatorer brukes også til komakorreksjon. Disse justeringene bør gjentakelsesreguleres til både Autostigmate- og Autocomafunctions lykkes med sin første gjentakelse. Om nødvendig kan et annet område velges (f.eks. støtte karbonfolie uten is), avbildedefokusjustert eller bildeanskaffelsestiden økt for å optimalisere signal-til-støy-forholdet i oppkjøpte bilder, og synligheten til flere Thon-ringer i Fourier-transformasjonen av de oppkjøpte bildene.
Moderne kryo-EM-mikroskoper genererer store mengder data som ofte overstiger 1 TB per datasett for å oppnå høyoppløselige 3D-rekonstruksjoner, spesielt for proteiner med lav symmetri. Cryo-EM-data og resultater kompletteres også vanligvis med data og resultater fra ortogonale metoder for å forstå strukturfunksjonsrelasjoner i hvert vitenskapelige prosjekt fullt ut. Organisering av innsamlede data, overføring til et datasamlebånd for bildebehandling og deling av en resulterende kryo-EM-rekonstruksjon blant samarbeidspartnere stiller ytterligere krav til nye brukere av cryo-EM-metodikk for å sette opp sin lokale IT-infrastruktur. Programvare for databehandling, for eksempel Athena, forenkler sentralisert lagring av data som er samlet inn av et tilkoblet instrument eller programvare som drives av en registrert bruker. Lagrede data og metadata er tilgjengelige ved hjelp av et enkelt nettlesergrensesnitt av flere brukere, som kan ha forskjellige roller i prosjektet med forskjellige tilgangsrettigheter (enten som eier, samarbeidspartner eller seer) basert på påloggingsinformasjon og datadelingsdefinisjon i eksperimentoppsettet. Denne digitaliseringen av eksperimentelle arbeidsflyter gir midler for deling av data og metadata mellom samarbeidspartnere uten unødvendig duplisering og øker produktiviteten og sporbarheten til brukte arbeidsflyter. Implementering av en generell og tilpassbar struktur av prosjekter, eksperimenter og arbeidsflyter i databehandlingsprogramvare er universell og muliggjør tilpasning og integrering av ortogonale eksperimenter ved hjelp av komplementære metoder i en enkelt prosjektdatabase.
Valg av områder for datainnsamlingen på et cryo-EM-rutenett er avgjørende for vellykket innsamling av datasett med høy oppløsning. Cryo-EM-gitter produsert med tradisjonelle dypfrysingsenheter, for eksempel Vitrobot (et helautomatisk vitrifiseringssystem), vil vanligvis vise en gradient av istykkelse over rutenettoverflaten (figur 4). Dette kan være gunstig ettersom rutenettet inneholder områder med forskjellige istykkelser; Områder med den ideelle istykkelsen for datainnsamling må imidlertid identifiseres som beskrevet i protokollen ovenfor. Et optimalt kryo-EM-rutenett bør inneholde så lite overføring isforurensning som mulig og inneholde nok rutenett firkanter med intakt hullete støttefolie. Innsamling av data på grid-firkanter som har sprekker eller ødelagte områder anbefales ikke, da innsamlede bilder vil bli påvirket av betydelig sterkere generell drift ved belysning av en elektronstråle i forhold til rutenettplassene med intakt støttefolie. Overskudd av krystallinsk is kan okkludere de fleste foliehull og/eller forstyrre autofokusering, og slike rutenettstorg bør også unngås. Rutenett firkanter med tynn is viser vanligvis store glassområder og mange lyse foliehull som er synlige i et bilde tatt ved hjelp av Atlas-forhåndsinnstillingen. Forekomsten av tykkere is nær rutenettstenger er å forvente og ukritisk ettersom foliehull i disse områdene av rutenettplassen er utelukket under Hullvalg-prosedyren. Tilstedeværelsen av flere tomme hull i en rutenett firkant kan bety at glassaktig is i de omkringliggende hullene er ekstremt tynn og kan inneholde skadede partikler eller ingen partikler i det hele tatt. Generelt er det lurt å velge rutenett firkanter med en rekke istykkelser på forskjellige regioner på rutenettet for innledende screening og vurdering for å forstå hvilke områder som har de beste forholdene for innsamling av data med høy oppløsning og viser den ideelle partikkeltettheten og orienteringsfordelingen. For apoF- og 20S-proteasomprøvene som brukes i denne studien, inneholder områder med den tynneste observerbare isen de beste forholdene for høyoppløselig avbildning av disse prøvene.
Når du velger hull automatisk i alle valgte rutenett firkanter ved hjelp av datainnsamlingsprogramvaren, anbefales det å utføre malutførelsesoppgave på et representativt hull i hver rutenett firkant for å sjekke og sikre at verken altfor tykke eller altfor tynne eller uventet ikke-glasslegeme firkanter ble valgt for datainnsamling. Under datainnsamlingen kan viktige kvalitetsindikatorer for innsamlede bilder, for eksempel bildedrift og CTF-tilpasning, overvåkes ved hjelp av EQM. Datainnsamling kan deretter optimaliseres ved å hoppe over områder som gir bilder av dårlig kvalitet. Bilder med høyoppløselig CTF-passform kan imidlertid fortsatt inneholde bilder med partikler i noen få foretrukne retninger eller partikler som er denaturert i et for tynt islag. Partikkelplukking i sanntid og 2D-klassifisering fra innsamlede bilder vil gi ytterligere informasjon om kvaliteten på strukturelle data i avbildede partikler og avsløre både foretrukne retninger av intakte partikler i is eller inkonsekvent struktur av (delvis) denaturerte partikler. Beregning av klassegjennomsnitt kan derfor bidra til å ytterligere avgrense passende regioner for datainnsamling, slik det allerede er implementert og vist i andre programvarepakker23,28.
Valg av bildeinnstillinger for datainnsamling, for eksempel forstørrelse, elektrondosehastighet og defokusområde, avhenger av flere kriterier, for eksempel måloppløsning, størrelse på proteinet, prøvekonsentrasjon, ønsket mikroskopgjennomstrømning, etc. For det direkte elektrondetektorkameraet som brukes i disse eksperimentene, ble elektrondosehastigheten valgt i området 4-5 e-/pix/s ved å velge en passende SPOT-størrelse og intensitet for å opprettholde parallell belysning. Som vist i tabell 1, kan en annen SPOT-størrelse brukes i forhåndsinnstillingen Hull/eusentrisk høyde for å sikre tilstrekkelig signal-til-støy-forhold i bildet for sentrering av hull under datainnsamling. Forstørrelsen bør velges slik at pikselstørrelsen er minst 2-3 ganger mindre enn måloppløsningen for cryo-EM-rekonstruksjonen. Imidlertid brukes den høyere forstørrelsen (dvs. mindre pikselstørrelse), det mindre synsfeltet er tatt i bilder, og det er mindre partikler per bilde, noe som til slutt fører til lengre datainnsamlingstid for å samle bilder med nok partikler til å rekonstruere 3D-kart til en høy oppløsning. For apoF-prøven brukte vi pikselstørrelsen på 0,43 Å da vi hadde tilstrekkelig prøvekonsentrasjon for høy tetthet av partikler i bilder og rettet under 2 Å-oppløsningen av rekonstruksjonen. For 20S-proteasomprøven brukte vi pikselstørrelsen på 0,68 Å til å dekke et større synsfelt i oppkjøpte bilder. Vanligvis for 200 kV TEM mikroskoper, er cryo-EM-bilder anskaffet i defokusområdet fra 0,8 til 2,0 μm. Men med det forbedrede kontrast- og signal-til-støy-forholdet ved hjelp av energifilteret, kan datainnsamlinger gjøres mye nærmere fokus for bedre å bevare høyoppløselig informasjon i oppkjøpte bilder på grunn av mindre avvik og tilsvarende redusert forfall av CTF-konvoluttfunksjonen. Vi bruker heller ikke en objektiv blenderåpning, da blenderåpningen kan introdusere flere bildeaberrasjoner, mens bildekontrasten allerede er tilstrekkelig forbedret ved hjelp av energifilteret. For apoF- og 20S-proteasomprøvene brukte vi defokusinnstillingene på 0,5 μm, 0,7μm og 0,9 μm. For mindre proteiner (<200 kDa) brukte vi defokusinnstillinger på -0,5 μm, -0,7 μm og -0,9 μm for å forbedre kontrasten til partikler og lette enklere partikkelplukking og innledende grov justering i 3D-raffineringstrinnet for 3D-rekonstruksjon, noe som førte til ~ 2,5 oppløsning Å 3D-kart (upubliserte resultater).
Vi har allerede vist at avbildning med et energifilter forbedrer signal-til-støy-forholdet (SNR) i cryo-EM-bilder samlet på high-end 300-kV TEM mikroskoper11. Faktisk, når elektroner passerer gjennom en prøve, oppstår to hovedtyper av interaksjoner: i) Elastisk spredte elektroner opprettholder sin energi og bidrar til bildedannelse ved forstyrrelser med den ikke-spredte hendelsesstrålen via fasekontrastmekanismen ii) uelastisk spredte elektroner mister litt energi i prøven og bidrar hovedsakelig til støy i bilder. Derfor kan SNR forbedres betydelig ved å filtrere de uelastisk spredte elektronene, som har lavere energi enn hendelsesstrålen og elastisk spredte elektroner, ved hjelp av en smal energispalte. Det er imidlertid viktig å bruke et tilstrekkelig stabilt energifilter, for eksempel Selectris eller Selectris-X, for å kunne bruke svært smale (10 eV eller mindre) spalter over lange (12+ timer) automatisert datainnsamling av høyoppløselige cryoEM-datasett.
Cryo-EM-bilder ervervet med 200 kV TEM-mikroskoper under samme forhold som med 300 kV TEM-mikroskoper viser mindre SNR ved høy oppløsning (spesielt <4 Å) på grunn av raskere forfall av CTF-konvoluttfunksjonene. Følgelig kreves et høyere antall partikler (og derfor et høyere antall innsamlede bilder) for å oppnå en viss oppløsning ved bruk av 200 kV TEMer. I tillegg er dybdeskarpheten (10-25 nm i oppløsningsområdet 2-3 Å) også omtrent 20% mindre i 200 kV-bilder35, noe som betyr at mindre partikler i islaget (vanligvis 20-50 nm tykk) vil være fullt i fokus og konstruktivt bidra til alle høyoppløselige funksjoner i en beregnet 3D-rekonstruksjon med mindre defokusverdier er raffinert for hver partikkel uavhengig i de senere stadiene av 3D-rekonstruksjonsprosedyren. For større partikler (som icosahedral virions eller andre makromolekylære forsamlinger), kan partikkelstørrelsen overstige dybdeskarpheten ved høye oppløsninger og introdusere fasefeil på grunn av planar-tilnærming av Ewald-sfæren i standard 3D-rekonstruksjonsalgoritmer36. Disse feilene kan forbedres av avanserte algoritmer som allerede er implementert i vanlige cryo-EM-bildebehandlingspakker 37,28,39. Siden Ewald-sfæren har større krumning i 200 kV-data enn 300 kV-data, er Ewald-sfærekorrigering nødvendig ved relativt lavere oppløsninger og/eller for relativt mindre makromolekylære samlinger ved bruk av 200 kV TEM-er. På den annen side viser 200 kV-bilder høyere kontrast av partikler i tynn is (20-50 nm) som er betydelig tynnere enn 200-300 keV-elektronen betyr fri bane (220-280 nm). Den høyere kontrasten bidrar til å forbedre riktig global justering av individuelle partikler, spesielt for svakt spredning av mindre proteiner hvis struktur ennå ikke er kjent, og 3D-referansemodellen er ennå ikke godt etablert.
Her demonstrerte vi på eksempelet på et 20S-proteasom at bildekontrast og kvalitet kunne forbedres på samme måte med et energifilter når du bruker et 200 kV TEM-mikroskop. Ved hjelp av samme antall partikler ble data samlet inn ved hjelp av 20 eV-spalten rekonstruert til 2,26 Å-oppløsning i forhold til data samlet inn med den fullt åpnede energispalten som bare ble rekonstruert til 2,34 Å-oppløsning. Den beste rekonstruksjonen ble oppnådd fra data samlet inn ved hjelp av 10 eV-spalten som ble rekonstruert til 2,14 Å-oppløsning. Disse resultatene er i samsvar med den teoretiske prediksjonen om at filtrering av de uelastisk spredte elektronene øker SNR i innsamlede bilder og letter høyere oppløsning i kryo-EM-rekonstruksjoner fra det gitte antall partikler, som oppsummert i tabell 4. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet av B-faktorene beregnet fra disse datasettene som indikerer høyere kvalitet på bilder i de energifiltrerede datasettene.
Vi kan derfor konkludere med at mens 300 kV TEM mikroskoper leverer den høyeste gjennomstrømningen og høyest mulig oppløsning i kryo-EM-rekonstruksjoner, gir 200 kV TEM-mikroskopene også datasett av høy kvalitet for høyoppløselige kryo-EM-rekonstruksjoner. Vi viste her at kvaliteten på oppkjøpte bilder, og derfor samlet tid til struktur, kan forbedres ytterligere ved å bruke 200 kV TEM utstyrt med et energifilter og en direkte elektrondetektor. Den presenterte protokollen beskriver alle nødvendige skritt for å rutinemessig skaffe høyoppløselige cryo-EM-data ved hjelp av dette oppsettet og avsløre fine strukturelle detaljer om makromolekylære 3D-strukturer, som er avgjørende for å forstå de viktigste strukturfunksjonsforholdene i strukturell biologi og strukturbasert legemiddeldesign.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
AutoGrid rings | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids. |
C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | Package of 100 clips that secure the standard EM grids inside the AutoGrid rings. |
Data Management Platform | Thermo Fisher Scientific | 1160939 | Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software |
EPU Quality Monitor | Thermo Fisher Scientific | 1179770 | |
EPU Software | Thermo Fisher Scientific | 1025080 | Part of the Glacios base configuration |
Ethane 3.5 | Westfalen | A06010110 | Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol) |
Falcon 4 200kV | Thermo Fisher Scientific | 1166936 | Direct electron detector |
Glacios | Thermo Fisher Scientific | 1149551 | 200 kV TEM |
GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification | Quorum | N/A | also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602) |
QuantiFoil grids | Quantifoil | N/A | R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid |
Relion | MRC Laboratory of Molecular Biology | N/A | open source software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/ |
Selectris with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191753 | Energy filter |
Selectris X with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191755 | Energy filter |
UltrAuFoil grids | Quantifoil | N/A | R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids |
Vitrobot Mk. IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | Automated vitrification system |
Whatman 595 filter paper | Thermo Fisher Scientific | AA00420S |