एक निरंतर-प्रवाह-पीसीआर माइक्रोफ्लुइडिक चिप में एस्चेरिचिया कोलाई का प्रवर्धन और केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रणाली के साथ इसका पता लगाना
Summary
यह प्रोटोकॉल बताता है कि माइक्रोफ्लुइडिक चिप के आधार पर एक निरंतर-प्रवाह-पोलीमरेज़ चेन सिस्टम कैसे बनाया जाए और प्रयोगशाला में केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का निर्माण कैसे किया जाए। यह प्रयोगशाला में न्यूक्लिक एसिड के विश्लेषण के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक लक्ष्य जीन के प्रवर्धन के लिए नियोजित एक पारंपरिक विधि है जिसने बायोमोलेक्यूलर डायग्नोस्टिक्स में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। हालांकि, कम तापमान भिन्नता दक्षता के कारण पारंपरिक पीसीआर बहुत समय लेने वाला है। यह काम एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर आधारित एक निरंतर-प्रवाह-पीसीआर (सीएफ-पीसीआर) प्रणाली का प्रस्ताव करता है। पीसीआर समाधान को विभिन्न तापमानों पर सेट किए गए हीटर पर रखे माइक्रोचैनल में चलाकर प्रवर्धन समय को बहुत कम किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) सकारात्मक और गलत-सकारात्मक पीसीआर उत्पादों को अलग करने का एक आदर्श तरीका है, डीएनए टुकड़ों के कुशल पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए एक सीई प्रणाली बनाई गई थी। यह पेपर इन-हाउस निर्मित सीएफ-पीसीआर सिस्टम द्वारा एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) के प्रवर्धन की प्रक्रिया और सीई द्वारा पीसीआर उत्पादों का पता लगाने का वर्णन करता है। परिणाम बताते हैं कि ई कोलाई के लक्ष्य जीन को 10 मिनट के भीतर सफलतापूर्वक प्रवर्धित किया गया था, यह दर्शाता है कि इन दो प्रणालियों का उपयोग न्यूक्लिक एसिड के तेजी से प्रवर्धन और पहचान के लिए किया जा सकता है।
Introduction
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक आणविक जीव विज्ञान तकनीक है जिसका उपयोग विशिष्ट डीएनए टुकड़ों को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जिससे डीएनए की ट्रेस मात्रा को लाखों बार बढ़ाया जाता है। यह नैदानिक निदान, चिकित्सा अनुसंधान, खाद्य सुरक्षा, फोरेंसिक पहचान और अन्य क्षेत्रों में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। पीसीआर प्रक्रिया में मुख्य रूप से तीन चरण होते हैं: 90-95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण, 50-60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 72-77 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार। थर्मल साइक्लिंग पीसीआर प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है; हालांकि, पारंपरिक पीसीआर थर्मल साइकलर न केवल भारी है, बल्कि अक्षम भी है, 25 चक्रों को पूरा करने के लिए लगभग 40 मिनट की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप के आधार पर एक निरंतर-प्रवाह पीसीआर (सीएफ-पीसीआर) प्रणाली का निर्माण किया गया था। सीएफ-पीसीआर पीसीआर समाधान को विभिन्नतापमानों 1,2,3,4,5 पर हीटर पर रखे माइक्रोचैनल्स में चलाकर समय बचा सकता है।
चूंकि केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) के कई फायदे हैं, जैसे कि उच्च रिज़ॉल्यूशन, उच्च गति, और उत्कृष्ट प्रजनन क्षमता 6,7,8,9,10,11, यह न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला में एक लोकप्रिय उपकरण बन गया है। हालांकि, अधिकांश प्रयोगशालाएं, विशेष रूप से विकासशील दुनिया में प्रयोगशालाएं, सीई उपकरण की उच्च कीमत के कारण इस तकनीक को बर्दाश्त नहीं कर सकती हैं। यहां, हमने सीएफ-पीसीआर माइक्रोफ्लुइडिक चिप बनाने और प्रयोगशाला में एक बहुमुखी सीई सिस्टम बनाने के तरीके के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार की है। हम इस सीएफ-पीसीआर प्रणाली द्वारा ई कोलाई के प्रवर्धन की प्रक्रिया और सीई प्रणाली द्वारा पीसीआर उत्पादों का पता लगाने की प्रक्रिया को भी प्रदर्शित करते हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करके, उपयोगकर्ताओं को माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स बनाने, पीसीआर समाधान तैयार करने, न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन के लिए सीएफ-पीसीआर प्रणाली बनाने और डीएनए टुकड़ों को अलग करने के लिए सीमित संसाधनों के साथ भी एक सरल सीई प्रणाली स्थापित करने में सक्षम होना चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
पीसीआर और सीई दोनों न्यूक्लिक एसिड के विश्लेषण में दो लोकप्रिय जैव प्रौद्योगिकी हैं। यह पेपर ई कोलाई के प्रवर्धन और सीएफ-पीसीआर और सीई सिस्टम का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों का पता लगाने का वर्णन कर?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को शंघाई नगर पालिका, चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (नंबर 19ZR1477500 और नंबर 18441900400) द्वारा समर्थित किया गया था। हम विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए शंघाई विश्वविद्यालय (संख्या 2017KJFZ049) से वित्तीय सहायता को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
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