連続フローPCRマイクロ流体チップにおける大 腸菌 の増幅とキャピラリー電気泳動システムによる検出
Summary
このプロトコルでは、マイクロ流体チップに基づいて連続フローポリメラーゼ鎖システムを構築する方法と、ラボでキャピラリー電気泳動システムを構築する方法について説明します。ラボでの核酸分析のための簡単な方法を紹介します。
Abstract
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、生体分子診断において重要な役割を果たしてきた標的遺伝子の増幅に用いられる従来の方法です。しかし、従来のPCRは温度変化効率が低いため、非常に時間がかかります。本研究では、マイクロ流体チップを用いた連続フローPCR(CF-PCR)システムを提案します。増幅時間は、異なる温度に設定されたヒーターに配置されたマイクロチャネルにPCR溶液を流すことで大幅に短縮できます。さらに、キャピラリー電気泳動(CE)は、陽性および偽陽性のPCR産物を区別するための理想的な方法であるため、DNA断片の効率的な分離を達成するためにCEシステムが構築されました。本稿では、自社構築のCF-PCR装置による大腸菌の増幅過程と、CEによるPCR産物の検出について述べる。その結果、大腸菌の標的遺伝子を10分以内に増幅することに成功し、核酸の迅速な増幅・検出に利用できることが示されました。
Introduction
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、特定のDNA断片を増幅するために使用される分子生物学的手法であり、それによって微量のDNAを数億倍に増幅します。臨床診断、医学研究、食品安全、法医学的識別などの分野で広く使用されています。PCRプロセスは、主に90〜95°Cでの変性、50〜60°Cでのアニーリング、72〜77°Cでの伸長の3つのステップで構成されています。 サーマルサイクリングはPCRプロセスの重要な部分です。しかし、従来のPCRサーマルサイクラーはかさばるだけでなく、非効率的でもあり、25サイクルを完了するのに約40分かかります。これらの制限を克服するために、マイクロ流体チップをベースにした連続フローPCR(CF-PCR)システムが社内で構築されました。CF-PCRは、異なる温度のヒーターに配置されたマイクロチャネルにPCR溶液を駆動することにより、時間を大幅に節約できます1,2,3,4,5。
キャピラリー電気泳動(CE)は、高分解能、高速、優れた再現性6,7,8,9,10,11など、多くの利点があるため、核酸やタンパク質の分析にラボで人気のあるツールとなっています。しかし、ほとんどのラボ、特に発展途上国のラボでは、CE機器の価格が高いため、この技術を購入する余裕がありません。ここでは、CF-PCRマイクロ流体チップの製造方法と、ラボで汎用性の高いCEシステムを構築する方法のプロトコルを概説しました。また、このCF-PCRシステムによる大腸菌の増幅プロセスとCEシステムによるPCR産物の検出についても説明します。このプロトコルに記載されている手順に従うことで、ユーザーはマイクロ流体チップを製造し、PCR溶液を調製し、核酸増幅用のCF-PCRシステムを構築し、限られたリソースでもDNA断片を分離するための簡単なCEシステムをセットアップできるはずです。
Protocol
Representative Results
Discussion
PCRとCEはどちらも、核酸の分析において人気のある2つのバイオテクノロジーです。本稿では、自社で構築したCF-PCRシステムとCEシステムを用いた 大腸菌 の増幅とPCR産物の検出について述べる。 大腸菌 の標的遺伝子は、熱伝達率が高いため、10分以内に増幅することに成功しました。1,500 bp 未満の DNA 断片は 8 分以内に分離されました(図 5)。これら2つの技?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国上海市科学技術委員会(No.19ZR1477500、No.18441900400)の支援を受けて行われました。上海大学科学技術支援(No.2017KJFZ049)の助成に感謝します。
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
