Ein chirurgisches Modell der Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion bei tibetischen Minischweinen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein schrittweises Verfahren zur Etablierung eines Minipig-Modells der Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion unter Verwendung absteigender Aortenkonstriktion. Die Methoden zur Beurteilung der Herzmorphologie, Histologie und Funktion dieses Krankheitsmodells werden ebenfalls vorgestellt.
Abstract
Mehr als die Hälfte der Fälle von Herzinsuffizienz (HF) werden weltweit als Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) klassifiziert. Großtiermodelle sind nur begrenzt geeignet, um die grundlegenden Mechanismen der HFpEF zu untersuchen und potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung des chirurgischen Vorgehens der absteigenden Aortenkonstriktion (DAC) bei tibetischen Minischweinen, um ein Großtiermodell der HFpEF zu etablieren. Dieses Modell nutzte eine präzise kontrollierte Verengung der absteigenden Aorta, um eine chronische Drucküberlastung in der linken Herzkammer zu induzieren. Mittels Echokardiographie wurden die morphologischen und funktionellen Veränderungen des Herzens beurteilt. Nach 12 Wochen DAC-Stress war das Ventrikelseptum hypertroph, aber die Dicke der Hinterwand war signifikant reduziert, begleitet von einer Dilatation des linken Ventrikels. Die LV-Ejektionsfraktion der Modellherzen wurde jedoch während des 12-wöchigen Zeitraums bei >50 % gehalten. Darüber hinaus zeigte das DAC-Modell Herzschäden, einschließlich Fibrose, Entzündung und Kardiomyozytenhypertrophie. Die Markerwerte für Herzinsuffizienz waren in der DAC-Gruppe signifikant erhöht. Diese DAC-induzierte HFpEF bei Minischweinen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung molekularer Mechanismen dieser Krankheit und für präklinische Tests.
Introduction
Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) macht mehr als die Hälfte der Herzinsuffizienzfälle aus und ist zu einemweltweiten Problem der öffentlichen Gesundheit geworden1. Klinische Beobachtungen haben auf mehrere kritische Merkmale der HFpEF hingewiesen: (1) ventrikuläre diastolische Dysfunktion, begleitet von erhöhter systolischer Steifigkeit, (2) normale Ejektionsfraktion in Ruhe mit beeinträchtigter Trainingsleistung und (3) kardiales Remodeling2. Zu den vorgeschlagenen Mechanismen gehören hormonelle Dysregulation, systemische mikrovaskuläre Entzündungen, Stoffwechselstörungen und Anomalien in sarkomeren und extrazellulären Matrixproteinen3. Experimentelle Studien haben jedoch gezeigt, dass eine Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion (HFrEF) diese Veränderungen verursacht. Klinische Studien haben die therapeutischen Wirkungen von Angiotensinrezeptor-Inhibitoren und Medikamenten zur Behandlung von HFrEF bei HFpEF 4,5 untersucht. Es sind jedoch einzigartige Therapieansätze für HFpEF erforderlich. Verglichen mit dem Verständnis der klinischen Symptome sind die Veränderungen in der Pathologie, Biochemie und Molekularbiologie der HFpEF nach wie vor schlecht definiert.
Tiermodelle der HFpEF wurden entwickelt, um die Mechanismen, diagnostischen Marker und therapeutischen Ansätze zu erforschen. Labortiere, einschließlich Schweine, Hunde, Ratten und Mäuse, können HFpEF entwickeln, und verschiedene Risikofaktoren, einschließlich Bluthochdruck, Diabetes mellitus und Alterung, wurden als Induktionsfaktoren ausgewählt 6,7. Zum Beispiel induziert Desoxycorticosteronacetat allein oder in Kombination mit einer fett-/zuckerreichen Ernährung HFpEF bei Schweinen 8,9. Die ventrikuläre Drucküberlastung ist eine weitere Technik, die zur Entwicklung von HFpEF in Groß- und Kleintiermodellen verwendet wird10. Darüber hinaus wurden in den letzten Jahren auf allen Kontinenten spezifische EF-Cut-off-Werte zur Definition von HFpEF eingeführt, wie in den Leitlinien der European Society of Cardiology, der American College of Cardiology Foundation/American Heart Association11, der Japanese Circulation Society/der Japanese Heart Failure Society12 zu sehen ist. Daher können viele bereits etablierte Modelle für HFpEF-Studien geeignet werden, wenn die klinischen Kriterien übernommen werden. Youselfi et al. behaupteten beispielsweise, dass ein genetisch veränderter Mausstamm, Col4a3-/-, ein wirksames HFpEF-Modell sei. Dieser Stamm entwickelte typische HFpEF-Herzsymptome, wie diastolische Dysfunktion, mitochondriale Dysfunktion und kardiales Remodeling13. In einer früheren Studie wurde eine energiereiche Diät verwendet, um bei Affen im Alter von14 Jahren einen kardialen Umbau mit einem mittleren EF-Bereich zu induzieren, der durch eine Stoffwechselstörung, Fibrose und reduzierte Aktomyosin-MgATPase im Myokard gekennzeichnet ist. Die transversale Aortenkonstriktion (TAC) der Maus ist eines der am weitesten verbreiteten Modelle zur Nachahmung der Hypertonie-induzierten ventrikulären Kardiomyopathie. Der linke Ventrikel verläuft von einer konzentrischen Hypertrophie mit erhöhter EF zu einem dilatativen Remodeling mit reduzierter EF15,16. Die Übergangsphänotypen zwischen diesen beiden typischen Stadien deuten darauf hin, dass die Aortenkonstriktionstechnik zur Untersuchung der HFpEF verwendet werden kann.
Die pathologischen Merkmale, die zelluläre Signalübertragung und die mRNA-Profile eines porcinen HFpEF-Modells wurden bereits veröffentlicht17. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Etablierung dieses Modells und die Ansätze zur Bewertung der Phänotypen dieses Modells vorgestellt. Das Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, der Operationsplan wurde gemeinsam vom leitenden Prüfarzt, Chirurgen, Labortechnikern und Tierpflegern erstellt. Die Minischweine wurden Gesundheitsuntersuchungen unterzogen, einschließlich biochemischer Tests und Echokardiographie. Nach der Operation wurden entzündungshemmende und schmerzstillende Eingriffe durchgeführt. Zur Beurteilung der Phänotypen wurden Echokardiographie, histologische Untersuchung und Biomarker eingesetzt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurden DAC-Techniken verwendet, um ein HFpEF-Modell für tibetische Minischweine zu entwickeln. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Vorbereitung von Tieren und Instrumenten vorgestellt, einschließlich Sedierung, trachealer Intubation, Venenkanülierung, chirurgischem Eingriff und postoperativer Versorgung. Die Aufnahmetechniken für echokardiographische B-Mode- und M-Mode-Herzbilder werden ebenfalls vorgestellt. Nach der DAC erlitt das Herz in den Wochen 4 und 6 eine linksventrikuläre Hype…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Guangdong Science and Technology Program (2008A08003, 2016A020216019, 2019A030317014), dem Guangzhou Science and Technology Program (201804010206), der National Natural Science Foundation of China (31672376, 81941002) und dem Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory of Laboratory Animals (2017B030314171) unterstützt.
Materials
| Absorbable surgical suture | Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China | 4-0 | |
| Aesthesia ventilator station | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China | WATO EX-35vet | |
| Aspirator | Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China | YX930D | |
| Benzylpenicillin | Sichuan Pharmaceutical. INC, China | H5021738 | |
| Disposal endotracheal tube with cuff | Shenzhen Verybio Co., Ltd, China | 20 cm, ID 0.9 | |
| Disposal transducer | Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China | ||
| Dissection blade | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China | ||
| Electrocautery | Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China | GD350-B | |
| Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit | Cusabio Biotech Co., Ltd, China | CSB-E08594r | |
| Eosin | Sigma-Aldrich Corp. | E4009 | |
| Flunixin meglumine | Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China | Shouyaozi(2012)-090242103 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich Corp. | H3136 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd, China | Veteasy for animals | |
| Laryngoscope | Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China | For adults | |
| LED surgical lights | Mingtai Medical Group, China | ZF700 | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific, USA | Multiskan FC | |
| Microscope | Leica, Germany | DM2500 | |
| Mobile restraint unit | Customized | N/A | A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover |
| Oxygen | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich Corp. | V900894 | |
| Patient monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China | Beneview T5 | |
| Peripheral Intravenous (IV) Catheter | Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China | 26G X 16 mm | |
| Propofol | Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd. | H20051842 | |
| Rib retractor | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Ruler | Deli Manufacturing Company, China | ||
| Scalpel handles | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Scissors (g) | Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China | ||
| Suture | Medtronic-Coviden Corp. | 3-0, 4-0 | |
| Ultrasonic gel | Tianjin Xiyuansi Production Institute, China | TM-100 | |
| Veterinary monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China | ePM12M Vet | |
| Veterinary ultrasound system | Esatoe, Italy | MyLab30 | Equiped with phased array transducer (3-8 Hz) |
| Xylazine hydrochloride injection | Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China | Shouyaozi(2016)-07003 | |
| Zoletil injection | Virbac, France | Zoletil 50 | Tiletamine and zolazepam for injection |
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