Dette arbeidet beskriver utviklingen av fleksible interdigiterte elektroder for implementering i 3D hjernesvulstmodeller, nemlig in vitro-kultur, i ovo-modell og in vivo murine modell. Den foreslåtte metoden kan brukes til å evaluere effekten av pulserende elektriske felt på svulster på forskjellige nivåer av kompleksitet.
Glioblastom er vanskelig å utrydde med standard onkologiske terapier på grunn av sin høye grad av invasivitet. Bioelektriske behandlinger basert på pulserende elektriske felt (PEF) er lovende for forbedring av behandlingseffektiviteten. Imidlertid er de avhengige av stive elektroder som forårsaker akutt og kronisk skade, spesielt i bløtvev som hjernen. I dette arbeidet ble fleksibel elektronikk brukt til å levere PEF til svulster, og den biologiske responsen ble evaluert med fluorescerende mikroskopi. Interdigitated gullelektroder på et tynt, gjennomsiktig parylen-C-substrat ble belagt med den ledende polymeren PEDOT: PSS, noe som resulterte i en konformbar og biokompatibel enhet. Effektene av PEF på svulster og deres mikromiljø ble undersøkt ved hjelp av ulike biologiske modeller. Først ble monolayers av glioblastomceller dyrket på toppen av elektrodene for å undersøke fenomener in vitro. Som et mellomliggende trinn ble det utviklet en in ovo-modell der konstruerte tumorsfæroider ble podet i den embryonale membranen til en vaktel. På grunn av fraværet av et immunsystem førte dette til svært vaskulariserte svulster. På dette tidlige utviklingsstadiet har embryoer ikke noe immunsystem, og svulster blir ikke gjenkjent som fremmedlegemer. Dermed kan de utvikle seg raskt mens de utvikler sine egne fartøy fra det eksisterende embryovaskulære systemet, som representerer en verdifull 3D-kreftmodell. Til slutt ble fleksibel elektrodelevering av PEF evaluert i en komplett organisme med et funksjonelt immunsystem, ved hjelp av en syngen, ortograft (intrakraniell) musemodell. Tumor sfæroider ble podet inn i hjernen til transgene multifluorescerende mus før implantasjon av fleksible organiske elektrodeenheter. Et forseglet kranialvindu muliggjorde multifotonavbildning av svulsten og dens mikromiljø under behandling med PEF over en periode på flere uker.
Glioblastoma multiforme (GBM) er en svært invasiv svulst og derfor vanskelig å utrydde med standardbehandlinger som reseksjon, strålebehandling og kjemoterapi. Til tross for multimodal behandling er prognosen fortsatt svært dårlig, og de fleste pasientene opplever sykdomsprogresjon innen 1 år etter diagnose 1,2. Nylig har utviklingen av bioelektriske behandlinger vist stort potensial for å forbedre eksisterende terapier. Disse terapiene bruker levering av pulserende elektriske felt (PEF), vanligvis i en enkelt behandlingsøkt, for å forstyrre cellulær membranintegritet og mikromiljøet til svulster. Denne cellemembranforstyrrelsen, også kjent som elektroporering, kan være reversibel eller irreversibel avhengig av elektrisk feltintensitet og antall pulser. Irreversibel elektroporering (IRE) brukes som en ikke-termisk vevsablasjonsteknikk der elektriske pulser forårsaker dødelig skade på cellulære membraner som fører til celledød3. Reversibel elektroporering brukes i elektrokjemoterapi (ECT), en etablert teknikk som består av levering av PEF i kombinasjon med kjemoterapimedisiner for å øke legemiddelopptaket i kreftceller4. Videre viste nyere studier kalsiumelektroporering som et alternativ til ECT med høy effektivitet for kreftbehandling, noe som også er billig og induserer færre bivirkninger5. Til tross for disse lovende fremskrittene, brukes PEF vanligvis ved hjelp av stive, metalliske elektroder som er kjent for å forårsake skade på bløtvev6. Hjernen er spesielt følsom for slike invasive enheter der det mekaniske misforholdet induserer betennelse og astroglial arrdannelse7.
I denne sammenheng presenteres et fleksibelt PEF-leveringssystem i kombinasjon med 3D-modeller av glioblastomtumorer, fra mikrofabrikasjon til en murinmodell. Konforme elektroder er laget med standard tynnfilmmikrofabrikasjonsprosesser, inkludert bruk av myke og biokompatible materialer som parylen-C, gull og PEDOT: PSS 8,9. En interdigitated elektrode design brukes til å dekke et stort overflateareal samtidig opprettholde tilstrekkelig gjennomsiktighet for avbildning mellom elektrodefingrene10. For tumormodellen produseres 3D-sfæroider av glioblastomceller som uttrykker en genetisk kodet fluorescensreporter ved hjelp av en variant av væskeoverlegget 96-brønnplatemetoden11. Sfæroidene er podet inn i chorioallantoic membranen til et vaktelembryo, noe som resulterer i en in ovo-modell som har blitt mye brukt til å studere angiogenese eller legemiddeltoksikologi12,13. Tumorer kan podes og vaskulariseres av embryoets vaskulatur i fravær av et immunsystem på dette stadiet av embryonal utvikling12. Fleksible elektroder plasseres deretter på toppen av den vaskulariserte svulsten for å studere effekten av PEF-levering på sfæroid og dens vaskulatur. Til slutt undersøkes disse effektene på en komplett levende organisme, inkludert tumormikromiljø og immunsystem, ved å implantere konstruerte sfæroider i hjerneparenkymet av murine modeller14. Fleksible elektroder plasseres på toppen av innføringsstedet, og kraniotomien er forseglet med et glassvindu, noe som tillater gjentatt to-foton avbildning over flere uker.
Disse metodene vil være nyttige for folk som er interessert i ulike domener som spenner fra mikroelektronikkteknikk til onkologiske applikasjoner. Mikrofabrikasjonsprotokollen kan brukes og tilpasses for alle bruksområder som krever tynnfilmmetallelektroder belagt med PEDOT: PSS. Videre vil de biologiske modellene utviklet for evaluering av antitumor elektriske behandlinger være av generell interesse for undersøkelsen av differensiering av cellulær, vaskulær og immunrespons mot implanterte materialer.
Tilnærmingen beskrevet i dette arbeidet gjør det mulig for hjernesvulstmodeller med et integrert PEF-leveringssystem å studere effekten av PEF på ulike nivåer av biologisk organisasjon. Mikrofabrikasjonsprotokollen består av standard tynnfilmprosesser, som gir en stor grad av frihet i elektrodedesign som kan tilpasses den spesifikke applikasjonen. Noen ganger kan et ekstra termisk glødningstrinn være nyttig på slutten av fabrikasjonen, for å redusere bøyning av elektrodene som oppstod under produksjonen.
Bruken av en stabil glioblastomcellelinje som uttrykker en fluorescerende kalsiumindikator, unngår alle komplikasjoner knyttet til fargestofflevering og retensjon, spesielt i 3D-svulster som er svært tette16. Faktisk observeres et høyt uttrykksnivå over en lang periode sammenlignet med standard kjemiske fluorescerende kalsiumindikatorer17. Denne protokollen kan brukes på forskjellige cellelinjer, da den vanligvis brukes til avbildning av nevral aktivitet11. Her ble humane og murine cellelinjer brukt (U87 og Gl261 for implantasjon i henholdsvis immundefekte eller immunkompetente mus). Faktisk viste nyere studier at U87-cellelinjen er forskjellig fra de opprinnelige cellene, da mange mutasjoner ble ervervet over år med cellekultur, noe som påvirket eksperimentell reprodusering18. Metoden som brukes til fremstilling av 3D-svulster er høy gjennomstrømning, reproduserbar, og tillater generering av sfæroider av en bestemt størrelse avhengig av cellelinjen, antall celler ved såing og tidspunktet for vekst19. Imidlertid er disse sfæroider tette, noe som gir en ulempe ved avbildning i kjernen av svulsten.
In ovo-modellen er nyttig som en første tilnærming for å studere effekten av PEF på 3D-svulster og deres vaskulatur, uten interaksjoner med andre celletyper som er tilstede i hjernen. Denne modellen er billig, rask, høy gjennomstrømning og reiser færre etiske problemer enn dyremodeller. Det er viktig å opprettholde embryoets integritet gjennom hele forsøket, da det kan påvirke overlevelsen og kvaliteten på avbildningen. Spesiell forsiktighet må tas mens du åpner vaktelegget, for å unngå skade på den embryonale membranen. Transplantatet og plasseringen av de fleksible elektrodene må også utføres nøye, for å unngå blødninger som kan drepe embryoet. Injeksjon av fluorescerende fargestoff i blodkarene tillater samtidig visualisering av tumorcellene og vaskularisering med fluorescensmikroskopi. Den intraokulære injeksjonen må utføres nøye for å unngå at fargestoff lekker inn i den embryonale væsken, noe som kan forårsake en gjenværende fluorescens i bakgrunnen som forringer kvaliteten på avbildningen. Denne modellen kan også brukes til å følge legemiddelopptak, da det gir tilgang til sirkulasjonssystemet. Imidlertid er eksperimenter begrenset av embryoets 12-dagers overlevelsestid, og tillater dermed 7 dagers observasjon, noe som er betydelig kortere enn in vivo-modellen 21.
In vivo hjernesvulstmodellen kan overvåkes i 4 til 5 uker før dyr når et etisk eksperimentelt endepunkt bestemt av et plutselig vekttap på 20%. Det tolereres godt og forblir på plass hvis elektrodens forbindelseshale ikke er for lang. Ellers har dyr en tendens til å skrape vippekontakten, som til slutt kan bli revet, og dermed forhindre påfølgende tilkobling til stimulatoren. Denne 4-ukers perioden er likevel verdifull for å dekke de ulike stadiene av glioblastomutvikling. Ved sammenligning av tumorcelletetthetene i samme volum av interesse ved forskjellige tidsintervaller, kan utviklingen av tumorvekstkinetikken observeres. Spesielt ble det observert økt tumorvekst på tidspunktet for immunbryteren22. En lignende studie i nærvær av en stimulerende elektrode ville informere om effekten av PEF på tumorproliferasjonshastighet og tumorfølsomhet for immuneliminering. I forhold til i ovo-modellen kan in vivo-modellen ses som en verdifull preklinisk modell for å studere virkningen av immunceller på tumorprogresjon og deres bidrag til den terapeutiske effekten av PEF. Denne protokollen er tilpasset fra en tidligere artikkel med tillegg av en fleksibel elektrodeanordning på svulsten før du plasserer et kranialvindu14. Både akutt og kronisk bioelektrisk behandling av svulster kan karakteriseres ved direkte og påfølgende observasjoner med to-foton mikroskopi gitt at innledende stimulering forventes å indusere celledød og å utløse varig dysregulering av immunresponsen.
Tilkoblingene til den fleksible sonden er lett tilgjengelige under to-foton mikroskopet. Elektriske stimuleringsparametere kan dermed justeres i sanntid basert på den observerte effekten på nevralvevet og / eller de målrettede cellene, på samme måte som en lege ville utføre intervensjonsprosedyrer mens han observerte MR- eller CT-bilder av pasienten. En siste vurdering er viktigheten av forsiktig forsegling av elektroden på hjernen med superlim og silikonlim for å forhindre vevsvekst.
Avslutningsvis representerer protokollen beskrevet her en innovativ modell for å studere effekten av PEF-terapi med fleksible organiske polymerelektroder for glioblastomtumormodeller. De to modellene viser forskjellige nivåer av kompleksitet slik at cellulære, vaskulære eller immuneffekter kan skilles for en bedre forståelse av virkningsmekanismene. Konforme, overfladiske elektroder reduserer den iatrogene skaden samtidig som de muliggjør forstyrrelse av tumormikromiljøet, utløser vasokonstriksjon eller dysregulering av intracellulært kalsium15.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet rapportert her ble støttet av det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR-18-CE19-0029). Forfatterne takker S.M. Bardet for hennes bidrag til genereringen av en stabil GCaMP6f cellelinje og D. O’Connor for hennes hjelp med in ovo-modellen .
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
96-well plate | Falcon | 353075 | |
Acetone | Technic | 530 | |
Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
agarose | Sigma | A9539 | |
autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
Buprenorphine | Axience | ||
Carprofen | Rimadyl | ||
Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
Flask | Greiner | 658170 | |
Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
Gold pellets – Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
Kapton tape SCOTCH 92 33×19 | 3M | Polyimide protection tape | |
Lab made pulse generator | |||
Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish | Falcon | 351029 | |
pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
Plastic mask | Selba | ||
Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
Propan-2-ol | Technic | 574 | |
Protolaser S | LPKF | ||
puromycin | Gibco | A11103 | |
Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
Scepter Sensors – 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
spin coater | Süss Microtec | ||
Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
Super glue | Office depot | ||
tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
Ultrasonic cleaner | VWR | ||
Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |