Denne protokol beskriver en metode til undersøgelse af elektrogene membranproteiner ved at måle ændringer i membranpotentiale. Dette assay giver en platform for funktionel aflæsning af flere ionkanaler, der endogent udtrykkes i epitelcellelinjer.
Fluorescensbaserede undersøgelser er velegnede til analyser af celler i kultur med høj kapacitet. De har været almindeligt anvendt til lægemiddelforskningskampagner rettet mod rekombinante ionkanalproteiner, der er overudtrykt i celler, såsom HEK-293-celler. Der lægges dog stigende vægt på brugen af vævsrelevante cellelinjer til at studere effekten af små molekyleinterventioner. Følgende protokol beskriver tilpasningen af et fluorescensbaseret membranpotentialeassay til undersøgelse af ionkanaler, der endogent udtrykkes i epitelcellelinjer. Membranpotentialeanalysen beskriver et assay med høj kapacitet for chloridkanalaktivitet af Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) i to almindeligt undersøgte epitelcellelinjer, Caco-2 og Calu-3. Derudover beskriver dette papir en ny anvendelse af dette system til måling af aktiviteten af epitelnatriumkanalen (ENaC) i et high-throughput format i de samme epitelcellelinjer. Sammen giver disse fluorescensbaserede assays en robust og fleksibel platform til at studere små molekylemodulatorer, der er målrettet mod to epitelkanaler i en relevant cellulær sammenhæng.
Fluorescensbaserede analyser med høj kapacitet af rekombinante kanalproteiner har været yderst effektive til at identificere småmolekylemodulatorer, der har potentiale til at blive fremtidige terapier 1,2,3,4. En almindelig metode til screening af små molekylebiblioteker for ionkanalmodulatorer er ved at måle ændringer i membranpotentialet. Disse skærme udføres typisk ved hjælp af rekombinante kanaler udtrykt heterologt i cellelinjer såsom HEK-293-celler 5,6,7.
Der er dog behov for validering af “hits” i relevante celletyper. Vi foreslår, at en sekundær skærm i relevante cellelinjer, der endogent udtrykker interessekanalerne, er ønskelig. En sådan sekundær screening vil identificere de modulatorer, der med størst sandsynlighed vil være effektive i endelige valideringsassays, der er afhængige af mindre tilgængeligt primært humant væv.
Der er også behov for analysesystemer, der har fleksibilitet til at rapportere aktiviteten af flere ionkanalmål i samme vævstype. For eksempel er der væsentlig offentliggjort litteratur, der understøtter konceptet om, at CFTR og ENaC funktionelt interagerer 8,9,10. Selvom flere velundersøgte epitelcellelinjer vides at udtrykke både CFTR og ENaC, er analysebetingelserne for at studere begge på en høj gennemstrømningsmåde til dato ikke blevet beskrevet.
Denne fluorescensbaserede membranpotentialeanalyse er alsidig, da den anvender en eksogen kemisk sonde til at måle funktionen af CFTR og ENaC og omgå behovet for genetisk kodede sonder11. Som bevis for princippet undersøges to almindeligt anvendte epitelcellelinjer som eksempler for at fremhæve de kritiske trin, der er nødvendige for at måle kanalaktivitet af både CFTR og ENaC.
Her har vi beskrevet fluorescensbaserede metoder til måling af CFTR- og ENaC-aktivitet i epitelkolorektal cancercellelinjen, Caco-2, og den humane epitellungekræftcellelinje, Calu-3. Disse membranpotentialeanalyser i epitelcellelinjer kan anvendes til at bekræfte effekten af små molekylemodulatorforbindelser, der tidligere er identificeret i heterologe ekspressionssystemer, forud for endelig in vitro-validering i primære patientafledte epitelkulturer.
Det er bydende nødvendigt at bekræfte, at ovenstående målinger passende tilskrives interessekanalen. For eksempel bør målingen, der tilskrives CFTR, vise afhængighed af CFTR-proteinekspression og den elektrokemiske drivkraft af chlorid, som moduleres af forskolin og inhibitoren CFTRInh-172. På samme måde kan membranpotentielle ændringer forårsaget af 10 μM amilorid tilskrives ENaC, hvis de er afhængige af ENaC-proteinekspression og en indadgående natriumdrivkraft. Selvom vi har bekræftet disse egenskaber af ENaC i MDCK-celler efter transfektion med alle tre underenheder af ENaC 2, har vi endnu ikke formelt bekræftet, at amiloridresponset målt iCaco-2– og Calu-3-celler tildeles af ENaC. Dette er især vigtigt, da amilorid kan modulere funktionen af natrium-protonbytteren NHE3 ud over ENaC13. Det kan tænkes, at den amilorid-inducerede hyperpolarisering, der observeres i dette assay, delvis kunne afspejle de indirekte virkninger af intracellulær forsuring på andre kanaler. For at bekræfte, at den amiloridinducerede hyperpolarisering målt ved hjælp af dette membranpotentialefølsomme farvestof tildeles af ENaC i ovenstående cellelinjer og mere komplekse cellesystemer, såsom iPSC-afledte væv, bekræfter vi, at denne aktivitet går tabt ved at slå en obligatorisk ENaC-underenhed (beta) ud i disse linjer.
Succesen med disse analyser kræver opmærksomhed på flere faktorer. For det første skal epitelkulturerne være sammenflydende og godt differentierede. Til måling af CFTR- og ENaC-funktion skal ca. 145.000 celler belægges pr. brønd i plader med 96 brønde eller 45.000 celler pr. brønd i plader med 384 brønde. Når epitelcellerne når sammenløbet (inden for 3-4 dage efter plettering), tillad 2-5 dages differentiering. Denne timing blev tidligere bestemt baseret på maksimal CFTR-proteinekspression ved immunoblotting14. Tilsvarende blev optimal timing bestemt for funktionel ENaC-ekspression i begge cellelinjer, Calu-3 og Caco-2.
Ikke-sammenflydende monolag eller celleovervækst fører til lav reproducerbarhed på tværs af tekniske replikater. I tilfælde, hvor celler i individuelle brønde ikke når sammenløb på samme tid, skal disse plader kasseres. Derudover kan ustabile baselineaflæsninger eller manglende stimuleringsrespons være en indikation af dårlig cellekvalitet, som skal udelukkes fra analyse. Reduceret respons på CFTR-aktivatoren, forskolin, eller ENaC-hæmmeren, amilorid, kan potentielt afspejle brugen af overdrevent passerede celler15. Selvom det ikke er et problem for Calu-3- og Caco-2-celler, klæber andre celler eller væv muligvis ikke godt til pladerne og kan kræve forbelægning af brøndene. For eksempel blev 2D cholangiocytkulturer i tidligere undersøgelser fastgjort til pladerne ved hjælp af kollagenbelægning16. Alternativt blev vedhæftningen af 2D tarmvæv øget under anvendelse af Poly-L-lysin2.
Ved test af modulering af ionkanaler med små molekyler ved hjælp af et fluorescensbaseret assay er det afgørende, at potentielle artefakter tildelt af de små molekylers fluorescerende egenskaber behandles. For at bekræfte specificiteten af funktionelle responser kan membranpotentialeanalyser valideres yderligere ved hjælp af konventionelle elektrofysiologiske metoder, såsom Ussing-undersøgelser17.
Efter at have bekræftet, at responsen detekteret af membranpotentialefølsomme farvestoffer specifikt tildeles af interessekanalen, har disse analyser et enormt potentiale til at validere lovende modulatorer af epitelionkanaler i deres relevante cellulære sammenhæng. Denne platform kan bygge bro mellem modulatorskærme med høj kapacitet i heterologe ekspressionssystemer og tidskrævende, bioelektriske målinger i vanskeligt tilgængelige primære væv.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Christopher Fladd og SPARC BioCentre på Hospital for Sick Children for deres hjælp med at udføre membranpotentialeassays, der måler CFTR og ENaC. Dette arbejde blev støttet af CFIT-programmet med finansiering fra CF Canada og Sick Kids Foundation. Dette arbejde blev finansieret af Canadas regering gennem Genome Canada og Ontario Genomics Institute (OGI-148). Denne undersøgelse blev finansieret af regeringen i Ontario. S.X. blev støttet af Canadian Association of Gastroenterology (CAG) Ph.D. Scholarship.
Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |