Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.
Op fluorescentie gebaseerde studies zijn geschikt voor high-throughput plaatlezertests van cellen in cultuur. Ze zijn vaak gebruikt voor campagnes voor het ontdekken van geneesmiddelen gericht op recombinante ionkanaaleiwitten die overexpressie hebben in cellen zoals HEK-293-cellen. Er wordt echter steeds meer nadruk gelegd op het gebruik van weefselrelevante cellijnen voor het bestuderen van de effecten van interventies met kleine moleculen. Het volgende protocol beschrijft de aanpassing van een op fluorescentie gebaseerde membraanpotentiaaltest voor de studie van ionkanalen die endogeen tot expressie komen in epitheelcellijnen. De membraanpotentiaaltest beschrijft een high-throughput assay voor chloridekanaalactiviteit van de Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in twee vaak bestudeerde epitheelcellijnen, Caco-2 en Calu-3. Daarnaast beschrijft dit artikel een nieuwe toepassing van dit systeem om de activiteit van het epitheliale natriumkanaal (ENaC) te meten in een high-throughput-formaat in dezelfde epitheelcellijnen. Samen bieden deze op fluorescentie gebaseerde assays een robuust en flexibel platform voor het bestuderen van kleine molecuulmodulatoren, gericht op twee epitheelkanalen in een relevante cellulaire context.
Op fluorescentie gebaseerde, high-throughput activiteitstests van recombinante kanaaleiwitten zijn zeer effectief geweest bij het identificeren van kleinmolecuulmodulatoren die het potentieel hebben om toekomstige therapieënte worden 1,2,3,4. Een veelgebruikte methode voor het screenen van kleine molecuulbibliotheken op ionkanaalmodulatoren is het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Meestal worden deze schermen uitgevoerd met behulp van recombinante kanalen die heterologe worden uitgedrukt in cellijnen zoals HEK-293-cellen 5,6,7.
Er is echter behoefte aan validatie van “hits” in relevante celtypen. We stellen voor dat een secundair scherm in relevante cellijnen die endogeen de kanalen van interesse uitdrukken, wenselijk is. Een dergelijk secundair scherm zal de modulatoren identificeren die het meest waarschijnlijk effectief zijn in uiteindelijke validatietests die afhankelijk zijn van minder toegankelijke primaire menselijke weefsels.
Er is ook behoefte aan testsystemen die de flexibiliteit hebben om de activiteit van meerdere ionkanaaldoelen in hetzelfde weefseltype te rapporteren. Er is bijvoorbeeld inhoudelijk gepubliceerde literatuur die het concept ondersteunt dat CFTR en ENaC functioneel interageren 8,9,10. Hoewel van verschillende goed bestudeerde epitheelcellijnen bekend is dat ze zowel CFTR als ENaC tot expressie brengen, zijn tot op heden de testomstandigheden voor het bestuderen van beide op een high-throughput manier niet beschreven.
Deze op fluorescentie gebaseerde membraanpotentiaaltest is veelzijdig, omdat het een exogene chemische sonde gebruikt om de functie van CFTR en ENaC te meten, waardoor de behoefte aan genetisch gecodeerde sondes wordt omzeild11. Als proof of principle worden twee veelgebruikte epitheelcellijnen bestudeerd als voorbeelden om de kritieke stappen te benadrukken die nodig zijn voor het meten van kanaalactiviteit van zowel CFTR als ENaC.
Hier hebben we fluorescentie-gebaseerde methoden beschreven voor het meten van CFTR- en ENaC-activiteit in de epitheliale colorectale kankercellijn, Caco-2, en de menselijke epitheliale longkankercellijn, Calu-3. Deze membraanpotentiaaltests in epitheelcellijnen kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van modulatorverbindingen met kleine moleculen, eerder geïdentificeerd in heterologe expressiesystemen, te bevestigen, voorafgaand aan de uiteindelijke in vitro validatie in primaire van de patiënt afgeleide epitheelculturen.
Het is noodzakelijk om te bevestigen dat de bovenstaande metingen op de juiste manier worden toegeschreven aan het kanaal van belang. De meting toegeschreven aan CFTR moet bijvoorbeeld afhankelijkheid aantonen van CFTR-eiwitexpressie en de elektrochemische drijvende kracht van chloride, die wordt gemoduleerd door forskoline en de remmer CFTRInh-172. Evenzo kunnen de membraanpotentiaalveranderingen veroorzaakt door 10 μM amiloride worden toegeschreven aan ENaC, als ze afhankelijk zijn van ENaC-eiwitexpressie en een inwaartse natriumdrijvende kracht. Hoewel we deze eigenschappen van ENaC in MDCK-cellen na transfectie met alle drie de subeenheden van ENaC 2 hebben bevestigd, hebben we nog niet formeel bevestigd dat de amiloriderespons gemeten in Caco-2- en Calu-3-cellen wordt verleend door ENaC. Dit is vooral belangrijk, omdat amiloride de functie van de natrium-protonenwisselaar NHE3 naast ENaC13 kan moduleren. Het is denkbaar dat de amiloride-geïnduceerde hyperpolarisatie die in deze test wordt waargenomen, gedeeltelijk de indirecte effecten van intracellulaire verzuring op andere kanalen zou kunnen weerspiegelen. Om te bevestigen dat de amiloride-geïnduceerde hyperpolarisatie gemeten met behulp van deze membraanpotentiaalgevoelige kleurstof wordt verleend door ENaC in de bovenstaande cellijnen en meer complexe celsystemen, zoals iPSC-afgeleide weefsels, bevestigen we dat deze activiteit verloren gaat door een obligate ENaC-subeenheid (bèta) in deze lijnen uit te schakelen.
Het succes van deze testen vereist aandacht voor verschillende factoren. Ten eerste moeten de epitheelculturen samenvloeiend en goed gedifferentieerd zijn. Voor de meting van de CFTR- en ENaC-functie moeten ongeveer 145.000 cellen per put worden geplateerd in 96-putplaten of 45.000 cellen per put in 384-putplaten. Zodra de epitheelcellen confluentie bereiken (binnen 3-4 dagen na plating), laat 2-5 dagen differentiatie toe. Deze timing werd eerder bepaald op basis van maximale CFTR-eiwitexpressie door immunoblotting14. Evenzo werd de optimale timing bepaald voor functionele ENaC-expressie in beide cellijnen, Calu-3 en Caco-2.
Niet-confluente monolagen of celovergroei leidt tot een lage reproduceerbaarheid over technische replicaties. In gevallen waarin cellen in individuele putten niet tegelijkertijd samenvloeiing bereiken, moeten deze platen worden weggegooid. Bovendien kunnen onstabiele basislijnmetingen of gebrek aan stimulatieresponsen een indicatie zijn van slechte celkwaliteit, die van analyse moet worden uitgesloten. Verminderde reacties op de CFTR-activator, forskoline of de ENaC-remmer, amiloride, kunnen mogelijk het gebruik van overmatig gepasseerde cellenweerspiegelen 15. Hoewel dit geen probleem is voor Calu-3- en Caco-2-cellen, hechten andere cellen of weefsels mogelijk niet goed aan de platen en moeten de putten mogelijk vooraf worden gecoat. In eerdere studies werden bijvoorbeeld 2D-cholangiocytenculturen aan de platen bevestigd met behulp van collageencoating16. Als alternatief werd de hechting van 2D-darmweefsels verhoogd met behulp van Poly-L-Lysine2.
Verder is het bij het testen van de modulatie van ionkanalen door kleine moleculen met behulp van een op fluorescentie gebaseerde test van cruciaal belang dat potentiële artefacten die worden verleend door fluorescerende eigenschappen van de kleine moleculen worden aangepakt. Om de specificiteit van functionele responsen te bevestigen, kunnen membraanpotentiaaltests verder worden gevalideerd met behulp van conventionele elektrofysiologische methoden, zoals Ussing-studies17.
Na bevestiging dat de respons gedetecteerd door membraanpotentiaalgevoelige kleurstoffen specifiek wordt verleend door het kanaal van belang, hebben deze testen een enorm potentieel om veelbelovende modulatoren van epitheliale ionkanalen in hun relevante cellulaire context te valideren. Dit platform kan de kloof overbruggen tussen high-throughput modulatorschermen in heterologe expressiesystemen en tijdrovende, bio-elektrische metingen in moeilijk toegankelijke primaire weefsels.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Christopher Fladd en SPARC BioCentre in het Hospital for Sick Children bedanken voor hun hulp bij het uitvoeren van de membraanpotentiaaltests die CFTR en ENaC meten. Dit werk werd ondersteund door het CFIT-programma met financiering van CF Canada en de Sick Kids Foundation. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese overheid via Genome Canada en het Ontario Genomics Institute (OGI-148). Deze studie werd gefinancierd door de regering van Ontario. S.X. werd ondersteund door de Canadian Association of Gastroenterology (CAG) Ph.D. Scholarship.
Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |