Denne protokollen beskriver en metode for studier av elektrogene membranproteiner ved å måle endringer i membranpotensial. Denne analysen gir en plattform for funksjonell avlesning av flere ionekanaler endogent uttrykt i epitelcellelinjer.
Fluorescensbaserte studier er egnet for plateleseranalyser med høy gjennomstrømning av celler i kultur. De har ofte blitt brukt til narkotikaoppdagelseskampanjer rettet mot rekombinante ionkanalproteiner overuttrykt i celler som HEK-293-celler. Det legges imidlertid økende vekt på bruk av vevsrelevante cellelinjer for å studere effekten av småmolekylære intervensjoner. Følgende protokoll beskriver tilpasningen av en fluorescensbasert membranpotensialanalyse for studiet av ionkanaler endogent uttrykt i epitelcellelinjer. Membranpotensialanalysen beskriver en høy gjennomstrømningsanalyse for kloridkanalaktiviteten til Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) i to ofte studerte epitelcellelinjer, Caco-2 og Calu-3. I tillegg beskriver denne artikkelen en ny anvendelse av dette systemet for å måle aktiviteten til epitelial natriumkanal (ENaC) i et høyt gjennomstrømningsformat i de samme epitelcellelinjene. Sammen gir disse fluorescensbaserte analysene en robust og fleksibel plattform for å studere småmolekylære modulatorer, rettet mot to epitelkanaler i en relevant cellulær kontekst.
Fluorescensbaserte aktivitetsanalyser med høy gjennomstrømning av rekombinante kanalproteiner har vært svært effektive for å identifisere småmolekylære modulatorer som har potensial til å bli fremtidige terapier 1,2,3,4. En vanlig metode for screening av små molekylbiblioteker for ionkanalmodulatorer er gjennom måling av endringer i membranpotensial. Vanligvis utføres disse skjermene ved hjelp av rekombinante kanaler uttrykt heterologt i cellelinjer som HEK-293-celler 5,6,7.
Det er imidlertid behov for validering av “treff” i relevante celletyper. Vi foreslår at en sekundær skjerm i relevante cellelinjer som endogent uttrykker kanalene av interesse er ønskelig. En slik sekundær skjerm vil identifisere de modulatorene som mest sannsynlig vil være effektive i endelige valideringsanalyser som er avhengige av mindre tilgjengelige primære menneskelige vev.
Det er også behov for analysesystemer som har fleksibilitet til å rapportere aktiviteten til flere ionkanalmål i samme vevstype. For eksempel er det substansiell publisert litteratur som støtter konseptet om at CFTR og ENaC funksjonelt samhandler 8,9,10. Selv om flere godt studerte epitelcellelinjer er kjent for å uttrykke både CFTR og ENaC, er analysebetingelsene for å studere begge på en høy gjennomstrømningsmåte hittil ikke beskrevet.
Denne fluorescensbaserte membranpotensialanalysen er allsidig, da den bruker en eksogen kjemisk sonde for å måle funksjonen til CFTR og ENaC, og omgå behovet for genetisk kodede sonder11. Som prinsippbevis studeres to ofte brukte epitelcellelinjer som eksempler for å markere de kritiske trinnene som er nødvendige for å måle kanalaktiviteten til både CFTR og ENaC.
Her har vi beskrevet fluorescensbaserte metoder for måling av CFTR- og ENaC-aktivitet i cellelinjen for kolorektal kolorektal kreft, Caco-2, og cellelinjen for humant epitellungekreft, Calu-3. Disse membranpotensialanalysene i epitelcellelinjer kan brukes til å bekrefte effekten av småmolekylære modulatorforbindelser, tidligere identifisert i heterologe ekspresjonssystemer, før endelig in vitro-validering i primære pasientderiverte epitelkulturer.
Det er viktig å bekrefte at de ovennevnte målingene er hensiktsmessig tilskrevet kanalen av interesse. For eksempel bør målingen som tilskrives CFTR vise avhengighet av CFTR-proteinuttrykk og den elektrokjemiske drivkraften til klorid, som moduleres av forskolin og hemmeren CFTRInh-172. På samme måte kan membranpotensialendringene forårsaket av 10 μM amilorid tilskrives ENaC, hvis de er avhengige av ENaC-proteinuttrykk og en innadgående natriumdrivkraft. Selv om vi har bekreftet disse egenskapene til ENaC i MDCK-celler etter transfeksjon med alle tre underenheter av ENaC 2, har vi ennå ikke formelt bekreftet at amiloridresponsen målt i Caco-2- og Calu-3-celler er gitt av ENaC. Dette er spesielt viktig, da amilorid kan modulere funksjonen til natrium-protonveksleren NHE3 i tillegg til ENaC13. Det kan tenkes at den amiloridinduserte hyperpolariseringen observert i denne analysen delvis kan gjenspeile de indirekte effektene av intracellulær forsuring på andre kanaler. For å bekrefte at den amiloridinduserte hyperpolariseringen målt ved hjelp av dette membranpotensialfølsomme fargestoffet tildeles av ENaC i de ovennevnte cellelinjene og mer komplekse cellesystemer, som iPSC-avledede vev, bekrefter vi at denne aktiviteten går tapt ved å slå ut en obligatorisk ENaC-underenhet (beta) i disse linjene.
Suksessen til disse analysene krever oppmerksomhet på flere faktorer. For det første må epitelkulturene være sammenflytende og godt differensiert. For måling av CFTR- og ENaC-funksjon bør ca. 145 000 celler belegges per brønn i 96-brønnsplater eller 45 000 celler per brønn i 384-brønnplater. Når epitelcellene når sammenløp (innen 3-4 dager fra plating), la 2-5 dager med differensiering. Denne timingen ble bestemt tidligere basert på maksimalt CFTR-proteinuttrykk ved immunoblotting14. Tilsvarende ble optimal timing bestemt for funksjonelt ENaC-uttrykk i begge cellelinjer, Calu-3 og Caco-2.
Ikke-konfluente monolag eller celleovervekst fører til lav reproduserbarhet på tvers av tekniske replikater. I tilfeller der celler i individuelle brønner ikke når samløp samtidig, bør disse platene kastes. I tillegg kan ustabile baselineavlesninger eller mangel på stimuleringsresponser være en indikasjon på dårlig cellekvalitet, som må utelukkes fra analysen. Redusert respons på CFTR-aktivatoren, forskolin eller ENaC-hemmeren, amilorid, kan potensielt gjenspeile bruk av overdrevent passerte celler15. Selv om det ikke er et problem for Calu-3- og Caco-2-celler, kan det hende at andre celler eller vev ikke fester seg godt til platene og kan kreve forbelegg av brønnene. For eksempel ble 2D-kolangiocytkulturer i tidligere studier festet til platene ved bruk av kollagenbelegg16. Alternativt ble adherensen av 2D tarmvev økt ved bruk av Poly-L-lysin2.
Videre, ved testing av modulering av ionkanaler av små molekyler ved hjelp av en fluorescensbasert analyse, er det avgjørende at potensielle gjenstander gitt av fluorescerende egenskaper til de små molekylene blir adressert. For å bekrefte spesifisiteten til funksjonelle responser, kan membranpotensialanalyser valideres ytterligere ved hjelp av konvensjonelle elektrofysiologiske metoder, for eksempel Ussing-studier17.
Etter å ha bekreftet at responsen detektert av membranpotensialfølsomme fargestoffer er spesifikt gitt av kanalen av interesse, har disse analysene et enormt potensial for å validere lovende modulatorer av epitelionkanaler i deres relevante cellulære kontekst. Denne plattformen kan bygge bro over gapet mellom modulatorskjermer med høy gjennomstrømning i heterologe ekspresjonssystemer og tidkrevende, bioelektriske målinger i vanskelig tilgjengelige primære vev.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Christopher Fladd og SPARC BioCentre ved Hospital for Sick Children for deres hjelp med å gjennomføre membranpotensialanalysene som måler CFTR og ENaC. Dette arbeidet ble støttet av CFIT-programmet med finansiering fra CF Canada og Sick Kids Foundation. Dette arbeidet ble finansiert av Canadas regjering gjennom Genome Canada og Ontario Genomics Institute (OGI-148). Denne studien ble finansiert av regjeringen i Ontario. SX ble støttet av Canadian Association of Gastroenterology (CAG) Ph.D. Stipend.
Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |