Detta protokoll beskriver en metod för studier av elektrogena membranproteiner genom att mäta förändringar i membranpotential. Denna analys ger en plattform för funktionell avläsning av flera jonkanaler endogent uttryckta i epitelcellinjer.
Fluorescensbaserade studier är lämpliga för plattläsaranalyser med hög genomströmning av celler i odling. De har ofta använts för läkemedelsupptäcktskampanjer riktade mot rekombinanta jonkanalproteiner överuttryckta i celler såsom HEK-293-celler. Det finns dock ökad tonvikt på användningen av vävnadsrelevanta cellinjer för att studera effekterna av småmolekylära interventioner. Följande protokoll beskriver anpassningen av en fluorescensbaserad membranpotentialanalys för studier av jonkanaler som uttrycks endogent i epitelcellinjer. Membranpotentialanalysen beskriver en high-throughput-analys för kloridkanalaktivitet hos CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) i två vanligt studerade epitelcellinjer, Caco-2 och Calu-3. Dessutom beskriver detta dokument en ny tillämpning av detta system för att mäta aktiviteten hos Epitelial Sodium Channel (ENaC) i ett högkapacitetsformat i samma epitelcellinjer. Tillsammans ger dessa fluorescensbaserade analyser en robust och flexibel plattform för att studera småmolekylära modulatorer, riktade mot två epitelkanaler i ett relevant cellulärt sammanhang.
Fluorescensbaserade aktivitetsanalyser med hög genomströmning av rekombinanta kanalproteiner har varit mycket effektiva för att identifiera småmolekylära modulatorer som har potential att bli framtida terapier 1,2,3,4. En vanlig metod för att screena småmolekylbibliotek för jonkanalmodulatorer är genom att mäta förändringar i membranpotential. Vanligtvis utförs dessa skärmar med användning av rekombinanta kanaler uttryckta heterologt i cellinjer såsom HEK-293-celler 5,6,7.
Det finns dock ett behov av validering av “träffar” i relevanta celltyper. Vi föreslår att en sekundär skärm i relevanta cellinjer som endogent uttrycker kanalerna av intresse är önskvärd. En sådan sekundär skärm kommer att identifiera de modulatorer som mest sannolikt är effektiva i slutliga valideringsanalyser som är beroende av mindre tillgängliga primära mänskliga vävnader.
Det finns också ett behov av analyssystem som har flexibiliteten att rapportera aktiviteten hos flera jonkanalmål i samma vävnadstyp. Till exempel finns det substantiell publicerad litteratur som stöder konceptet att CFTR och ENaC funktionellt interagerar 8,9,10. Även om flera välstuderade epitelcellinjer är kända för att uttrycka både CFTR och ENaC, har analysförhållandena för att studera båda på ett högt genomströmningssätt hittills inte beskrivits.
Denna fluorescensbaserade membranpotentialanalys är mångsidig, eftersom den använder en exogen kemisk sond för att mäta funktionen av CFTR och ENaC, vilket kringgår behovet av genetiskt kodade sonder11. Som principbevis studeras två vanliga epitelcellinjer som exempel för att belysa de kritiska steg som är nödvändiga för att mäta kanalaktivitet för både CFTR och ENaC.
Här har vi beskrivit fluorescensbaserade metoder för att mäta CFTR- och ENaC-aktivitet i den epiteliala kolorektalcancercellinjen, Caco-2, och den humana epiteliala lungcancercellinjen, Calu-3. Dessa membranpotentialanalyser i epitelcellinjer kan användas för att bekräfta effekten av småmolekylära modulatorföreningar, som tidigare identifierats i heterologa expressionssystem, före slutlig in vitro-validering i primära patient-härledda epitelkulturer.
Det är absolut nödvändigt att bekräfta att ovanstående mätningar på lämpligt sätt tillskrivs kanalen av intresse. Till exempel bör mätningen som tillskrivs CFTR visa beroende av CFTR-proteinuttryck och den elektrokemiska drivkraften för klorid, som moduleras av forskolin och hämmaren CFTRInh-172. På liknande sätt kan membranpotentialförändringar orsakade av 10 μM amilorid hänföras till ENaC, om de är beroende av ENaC-proteinuttryck och en inåtgående natriumdrivkraft. Även om vi har bekräftat dessa egenskaper hos ENaC i MDCK-celler efter transfektion med alla tre subenheterna av ENaC 2, har vi ännu inte formellt bekräftat att amiloridsvaret uppmätt iCaco-2– och Calu-3-celler tilldelas av ENaC. Detta är särskilt viktigt, eftersom amilorid kan modulera funktionen hos natrium-protonbytaren NHE3 utöver ENaC13. Möjligen kan den amiloridinducerade hyperpolarisationen som observerats i denna analys delvis återspegla de indirekta effekterna av intracellulär försurning på andra kanaler. För att bekräfta att den amiloridinducerade hyperpolarisationen mätt med detta membranpotentialkänsliga färgämne tilldelas av ENaC i ovanstående cellinjer och mer komplexa cellsystem, såsom iPSC-härledda vävnader, bekräftar vi att denna aktivitet går förlorad genom att slå ut en obligatorisk ENaC-underenhet (beta) i dessa linjer.
Framgången för dessa analyser kräver uppmärksamhet på flera faktorer. För det första måste epitelkulturerna vara sammanflytande och väl differentierade. För mätning av CFTR- och ENaC-funktionen bör cirka 145 000 celler pläteras per brunn i 96-brunnsplattor eller 45 000 celler per brunn i 384-brunnsplattor. När epitelcellerna når sammanflödet (inom 3-4 dagar från plätering), tillåta 2-5 dagars differentiering. Denna tidpunkt bestämdes tidigare baserat på maximalt CFTR-proteinuttryck genom immunoblot14. På liknande sätt bestämdes optimal timing för funktionellt ENaC-uttryck i båda cellinjerna, Calu-3 och Caco-2.
Icke-konfluenta monolager eller cellöverväxt leder till låg reproducerbarhet över tekniska replikat. I de fall där celler i enskilda brunnar inte når sammanflöde samtidigt, ska dessa plattor kasseras. Dessutom kan instabila baslinjeavläsningar eller brist på stimuleringssvar vara en indikation på dålig cellkvalitet, vilket måste uteslutas från analys. Minskade svar på CFTR-aktivatorn, forskolin, eller ENaC-hämmaren, amilorid, kan potentiellt återspegla användningen av alltför passagerade celler15. Även om det inte är ett problem för Calu-3- och Caco-2-celler, kan andra celler eller vävnader inte fästa bra på plattorna och kan kräva förbeläggning av brunnarna. Till exempel, i tidigare studier, fästes 2D-kolangiocytkulturer på plattorna med användning av kollagenbeläggning16. Alternativt ökade vidhäftningen av 2D-tarmvävnader med användning av Poly-L-lysin2.
Vid testning av modulering av jonkanaler med små molekyler med hjälp av en fluorescensbaserad analys är det dessutom viktigt att potentiella artefakter som tilldelas av fluorescerande egenskaper hos de små molekylerna behandlas. För att bekräfta specificiteten av funktionella svar kan membranpotentialanalyser valideras ytterligare med konventionella elektrofysiologiska metoder, såsom Ussing-studier17.
Efter att ha bekräftat att svaret detekterat av membranpotentialkänsliga färgämnen specifikt ges av kanalen av intresse, har dessa analyser enorm potential att validera lovande modulatorer av epiteljonkanaler i deras relevanta cellulära sammanhang. Denna plattform kan överbrygga klyftan mellan modulatorskärmar med hög genomströmning i heterologa uttryckssystem och tidskrävande, bioelektriska mätningar i svårtillgängliga primära vävnader.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Christopher Fladd och SPARC BioCentre vid Hospital for Sick Children för deras hjälp med att genomföra membranpotentialanalyserna som mäter CFTR och ENaC. Detta arbete stöddes av CFIT-programmet med finansiering från CF Canada och Sick Kids Foundation. Detta arbete finansierades av Kanadas regering genom Genome Canada och Ontario Genomics Institute (OGI-148). Denna studie finansierades av Ontarios regering. S.X. stöddes av Canadian Association of Gastroenterology (CAG) Ph.D. Stipendium.
Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |