表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング
Summary
本プロトコルは、HA、S糖タンパク質、関連するハイブリッド型グリカン、および高マンノースオリゴ糖へのCV-N結合を調べるためのSPR結合アッセイのための新しいツールについて説明しています。SPRは、これらのグリカンに二量体または単量体CV-Nのいずれかを結合するためのKD を決定するために使用される。
Abstract
表面プラズモン共鳴(SPR)は、ドメインスワップされたシアノビリン-N(CV-N)二量体へのヘマグルチニン(HA)結合を測定し、マンノシル化ペプチドとCV-Nの高親和性結合部位との間の相互作用を監視するために使用されます。ウイルスエンベロープスパイクgp120、HA、およびエボラ糖タンパク質(GP)1,2は、二量体CVN2上の高親和性および低親和性結合部位の両方に結合することが報告されています。ジマンノシル化HAペプチドはまた、CVN2の改変分子への2つの低親和性結合部位で結合しており、CVN2はそれぞれのリガンドに対して高親和性部位を有し、糖鎖結合ポケット内の安定化ジスルフィド結合を置き換えるために変異しているため、多価結合が確認されます。HA結合は、275 nMの解離定数(KD)で疑似抗体CVN2の1つの高親和性結合部位に示され、オリゴマー化によってヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)をさらに中和します。ドメインスワップCVN2のジスルフィド架橋の数は、シスチンをグルタミン酸とアルギニンの極性残基対に置き換えることで4から2に減少し、HAに対する結合親和性が低下します。最も強い相互作用の中で、エボラGP1,2は、膜貫通ドメインのないエンベロープグリカンを使用して、低ナノモル範囲の2つの高親和性結合部位を持つCVN2によって結合されます。本研究では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)スパイク(S)糖タンパク質への多重特異性モノマーCV-Nの結合は、他のウイルススパイクへのナノモルKDと比較して、および中μモル範囲のその受容体結合ドメインを介して、KD = 18.6 μMで測定されます。
Introduction
テザリン関連抗ウイルス活性は、インターフェロンαによって誘導され、タンパク質ベースのテザーを含み、感染した細胞表面上に完全に形成されたビリオンの保持をもたらす1。ウイルス放出の阻害におけるテザリングリコシル化の必要性は依然として不明であり、in vitro研究のための組換え発現グリカン上のグリコシル化パターンの重要性を示唆しています1,2、これは(インフルエンザウイルスの場合)表面発現インフルエンザ赤血球凝集素HA 3,4の立体配座に依存します。.N結合型グリコシル化につながれたオリゴ糖の修飾は、HIVタイプ1型放出のテザリン媒介制限に十分であり、二量体化はウイルス放出の防止に不可欠な役割を果たし、それによって出芽ビリオンをつなぐための膜貫通ドメインまたはグリコシル-ホスファチジル-イノシトール(GPI)アンカーが関与することが注目されています5。.ヒトおよびマウステザリンが複数のエンベロープウイルス、レトロウイルス、およびフィロウイルスをブロックするための独自の機能が説明されています。BST-2/テザリンは、自然免疫1,6のインターフェロン誘導性抗ウイルスタンパク質であり、広域スペクトルの抗ウイルス活性で作用し、エンベロープ糖タンパク質5によって拮抗され、テザリンを転座させるか、テザリン6の構造を破壊します。例えば、A型インフルエンザウイルス上で表面発現されたエンベロープ糖タンパク質HAおよびノイラミニダーゼは、株特異的な様式7におけるテザリン拮抗作用についてよく知られており、宿主受容体結合部位の認識を容易にする8。糖鎖標的抗体は、HA上の急速にカスタマイズされた糖鎖シールドとの相互作用の化学量論で研究され、インフルエンザAのH3N2およびH1N1サブタイプ4への結合親和性をもたらします。
抗ウイルス剤とウイルスエンベロープスパイク(糖鎖リガンド)の結合機構を解明するために、モノマンノース、ジマンノース、トリマンノース部分を化学合成します。マンノシル化ペプチドは、グリコシル{β}-過酢酸塩から1,2-トランスグリコシルアジド変換9へのアジドグリコシル化によって生成され、生命を脅かすウイルスの表面に通常見られるN-アセチルグルコサミンおよび高マンノースオリゴ糖を模倣します。トリアゾールバイオアイソスターは、HAペプチド10のマンノシル化残基を形成する結合を模倣し、HAヘッドドメイン上の2番目のN結合型グリコシル化スポット(4つのN結合型糖鎖N54、N97、N181、N301を有するHAトップ)8,11,12の周りの抗ウイルスCV-N誘導体との部位特異的相互作用を促進するために利用されます。.グルタミン酸(Glu)とアルギニン(Arg)の間の相互作用と結果として生じるらせん双極子は、モデルペプチドとタンパク質の両方の良好な安定性を示しましたが、SPRを使用して視覚化されます。糖鎖部分への受容体結合を直接阻害することによってHA10上の単一の化学合成グリコシル化部位を認識することと比較した場合、その受容体に対する4部位変異Fc構造のより高い親和性がインビボでエフェクター機能を惹起することが示され、Fc変異体に結合したN結合型糖鎖の無関係な組成が機構的に決定されることが明らかになった13。
CV-Nは、HIV 14,15、インフルエンザ16、およびエボラウイルスに対する抗ウイルス活性を示し、エンベロープスパイクタンパク質12,17,18,19上の高マンノースオリゴ糖修飾へのナノモル結合によって媒介されます。CV-Nにおける1つの高親和性糖鎖結合部位(H)または共有結合した二量体CVN2における2つのHsへのインフルエンザHA結合は、それぞれ平衡解離定数(KD)= 5.7 nM(図1A)およびKD = 2.7 nMを有すると決定される。CV-NおよびCVN2はいずれも、別の1つまたは2つの低親和性炭水化物結合部位(L)12,17,20,21を有する。エボラGP1,2は、より低いナノモル範囲(KD = 26nM)の親和性を有するCVN2の2Hに結合する。エボラGP1,2およびHAに結合するCV-N WTは、KD = 34 nMからKD = 5.7 nMまでの親和性を示す(A/New York/55/04)12。ウイルスエンベロープ上の高マンノースグリカンを特異的に標的とするCV-Nなどのレクチンは、C型肝炎ウイルス、SARS-CoV、ヘルペスウイルス、マールブルグウイルス、および麻疹ウイルス22の複製をさらに阻害します。
低分子CV-N分子は、広範囲のウイルスに結合してウイルスの侵入を阻害するように機能するため、20年以上にわたって徹底的に研究されてきました16,18。構造解析および結合親和性アッセイは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質に対する結合活性を高めるために、マイクロモル範囲の二価結合によるドメインスワップCVN2ダイマー内の2つのLの架橋を示しています10,19。Man(8)D1D3アームおよびMan(9)に対するManα1-2Manαの選択的結合は、反対のタンパク質プロトマー20上に位置する異なる親和性の2つの結合部位を含み、それによってナノモル結合親和性に達する(図1B)。したがって、CVN2は、ウイルス中和抗体と同様に、HIV gp120上のエピトープに結合するその応用に関する疑似抗体と見なされます17。ここで、著者は、CVN2の受容体結合ドメイン(RBD)を介したSARS-CoV-2スパイクへの潜在的な結合を調査することに関心があります。固定化されたヒトアンジオテンシン変換酵素(ACE)-2とSARS-CoV-2 RBDとの結合曲線は、この生物学的に関連する結合相互作用についてKD = 4.7 nMをもたらします23。
対照的に、選択された免疫グロブリンクラスは、特異的で一貫した構造タンパク質パターンを認識し、膜固定HA領域24における親和性成熟のための基質を付与する。CV-Nは、ほぼすべてのインフルエンザAおよびBウイルス16において非常に強力な活性を示し、広範に中和する抗ウイルス剤である。私たちの知識は、高中和抗体による糖鎖標的化のためのエピトープ構造を含む可能性のあるHA1およびHA2のステム上の標的エピトープの位置について、およびレクチン結合と比較して不完全です25。
図1:CV-NからウイルスエンベロープスパイクへのSPR結合アッセイの概略図。 (A)リガンドへのCV-N結合のためのSPRアッセイ:HA全長タンパク質(90kDa)。インフルエンザHA A /ニューヨーク/55/04(H3N2)へのリアルタイムの二重参照結合を示す運動データセット(5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、0 nM)。(B)CVN2L0変異体V2は、500nM〜16μMの濃度範囲内で固定化リガンドDMに結合する。 配列:L残基は黄色で強調表示されています。H残基は灰色で強調表示されます。E58およびR73は野生型タンパク質のシステインの置換であり、V2を4つのジスルフィド結合ではなく3つのジスルフィド結合を有する安定なタンパク質フォールドにする。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
膜遠位HA上部上の糖鎖シールドはCV-N 12への高親和性結合を誘導するのに対し、CVN2はHA上部のジスルフィド架橋に隣接するHAへの結合が、その低親和性部位でさらに観察されている10,12。様々な極性相互作用および相互作用部位がCV-Nによる糖鎖結合において同定される。これらの相互作用は、結合部位にノックアウト変異体を生成して、in silico予測グリコシル化12に対する結合親和性を相関させることによって検証される。したがって、このプロジェクトは、結合親和性と特異性において以前にテストされた化学的にマンノシル化されたHAペプチドを、少数の異なるN結合型グリコシル化部位とO結合型グリコシル化によって自然に修飾されたSARS関連の2019-nCoVスパイクおよびSARS-CoV-2からの短いペプチド配列と比較することを目的としています。今回、Pintoたちの研究グループは、クライオ電子顕微鏡法と結合アッセイを用いて、受容体付着と競合することなく、サルベコウイルス亜属内の保存された糖鎖を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質のエピトープを認識する可能性のあるモノクローナル抗体S309を報告している26。この研究のプロトコルは、CV-NおよびCVN2がSPR技術を使用してグリコシル化タンパク質および合成マンノシル化ペプチドにどのように結合するかを研究するために、CV-N変異体の設計、発現、および特性評価がどのように重要であるかを説明しています10,12。
タンデム結合二量体CVN2L027および結合部位変異体(V2-V5)は組換え的に発現され、変異体はジスルフィド結合置換体(C58EおよびC73R)を有する(図2A)。また、一点変異E41Aを有する変異体が調製されるのは、この位置が分子間交差接触残基として見られたからである。この変異体は、レクチンと高マンノースオリゴ糖の間のSPR結合測定のための別の興味深い分子であり、結合ドメインを解読し、二量体型との比較を可能にします。CVN2のドメインスワップ結晶構造は、49〜54残基に及ぶ柔軟なリンカーを示しています。2つのドメインは、剛体としてヒンジの周りを移動し続けることができ、分子内ドメイン相互作用を介してモノマー(ドメインA-残基1-39;90-101-とドメインB-残基40-89)または分子間ドメインスワッピングによって二量体[ドメインA(第1のモノマー)とドメインB(第2のコピー)、およびドメインB(第1のモノマー)とドメインA(第2のコピー)]のいずれかを発達させる。2つのプロトマーのAドメインとBドメインの間には、Glu4128を除いて密接な相互作用はありません。CV-Nの遺伝子は、40量体合成オリゴ29を用いた反復PCR法を用いて開発することができ、次いで、Keeffe, J.R.27によって記載されているように、電気コンピテント細胞への形質転換(エレクトロポレーション)のためにpET11aのNdeIおよびBamHI部位にサブクローニングされる。それぞれの結晶構造(PDB ID 3S3Y)を達成するために使用されるタンパク質は、N末端6-ヒスチジン精製タグとそれに続く第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含む。部位特異的突然変異誘発は、アミノ酸交換のために、点突然変異を起こし、コドンを切り替え、単一または複数の塩基またはコドンを挿入または欠失するために利用される。これらの形質転換は、タンパク質の機能と構造に関する貴重な洞察を提供します。組換え発現および精製されたCV-N、CVN2、およびCVN3は、生物物理学的によく研究されており20、21、27、製造が安価であるため、SPRセンサーチップに固定化されたグリカンへの結合アッセイの特性評価に使用されます。従来の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、糖鎖リガンドの固定化技術に関する再現性が低く、SPRで示されているさまざまな結合部位変異体のリアルタイム結合をエンドポイントアッセイに変換します。
結合親和性バリアントCVN2L0-V2(ジスルフィド架橋置換10を有するホモ二量体CV-Nのインタクトフォールド)を大腸菌(大腸菌)のHisタグで発現させ、アフィニティークロマトグラフィーを適用してNi-NTAカラムで精製し、SPRを用いてHA(H3N2)、モノマンノシル化HAペプチドおよびジマンノシル化HAペプチドへの結合について試験した。 化学的にマンノシル化ペプチド、またはHAおよびSタンパク質、すべてが親水性チップ表面に結合したリガンドおよびアミン反応性エステルまたはビオチン-ストレプトアビジンタンパク質工学を介して。逐次実行の同じ手順をこれらのリガンドに適用し、CV-Nの様々な希釈液およびCV-N(およびCVN2)の変異体を注入して、以下に説明するように分子間相互作用分析のための速度論的情報を得る30。RBD固定化SPRセンサーチップは、CV-NからSペプチドへの結合研究に使用され、ヒトACE2とのSARS-CoV-2結合との親和性と比較されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
CV-Nの結合親和性は、機能的結合部位の数と相関しています[ドメインBでは2H、ドメインスワップダイマーとして操作された場合はドメインAでは2L]。結合親和性が変化する変異体(CVN2L0-V2、ジスルフィド架橋ノックアウトを含むCV-Nのホモ二量体安定フォールド)を大腸菌で発現させ、精製し、SPR10を用いてHAタンパク質(H3N2)への結合について積極的に試験し、HAをHまたはL?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、ウィーン工科大学のバイオテクノロジーおよび微生物学部門およびウィーン医科大学の腎臓学および透析部門の医学部IIIのクリスチャン・ダーントル博士、特に技術的および科学的支援のためのマルクス・ワールマン博士を認めています。哺乳類細胞におけるタンパク質発現は、ウィーン天然資源生命科学大学(BOKU)のバイオテクノロジー学部によってサポートされました。著者は、ドイツのデュッセルドルフにあるXanTecバイオアナリティクスのNico Dankbar博士に、SPR結合アッセイの実施に関する有益な科学的議論について深い感謝の意を表したいと考えています。
Materials
| Äkta primeplus | Cytiva | ||
| Amicon tubes | Merck | C7715 | |
| Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
| Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
| Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
| Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
| Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
| Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
| Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
| DTT | Merck | DTT-RO | |
| EDC | Merck | 39391 | |
| EDTA | Merck | E9884 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| Glycine HCl | Merck | 55097 | |
| HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
| Imidazole | Merck | I2399 | |
| IPTG | Merck | I6758 | |
| Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
| LB agar | Merck | 52062 | |
| LB agar | Merck | 19344 | |
| LB Lennox | Merck | L3022 | |
| Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
| Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
| NaH2P04 | Merck | S0751 | |
| NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| NaOH | Merck | S5881 | |
| NHS | Merck | 130672 | |
| NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
| PBS | Merck | 806552 | |
| PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
| Peptone | Merck | 70171 | |
| pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
| Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
| Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
| Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
| SDS | Merck | 11667289001 | |
| Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
| Sodim chloride | Merck | S9888 | |
| Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
| SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
| SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
| Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
| TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
| Triton-X100 | Merck | T8787 | |
| Tryptone | Merck | 93657 | |
| Tween20 | Merck | P1379 | |
| Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
| X-gal | Merck | XGAL-RO | |
| XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
| Yeast extract | Merck | Y1625 |
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