هندسة العوامل المضادة للفيروسات عبر رنين البلازمون السطحي
Summary
يصف البروتوكول الحالي أدوات جديدة لمقايسات ربط SPR لفحص ارتباط CV-N ب HA ، والبروتين السكري S ، والجليكان الهجين ذي الصلة ، والسكريات قليلة السكاريد عالية المانوز. يستخدم SPR لتحديد KD لربط إما ثنائي أو أحادي CV-N بهذه الجليكانات.
Abstract
يستخدم رنين البلازمون السطحي (SPR) لقياس ارتباط الهيماجلوتينين (HA) بثنائي ثنائي السيانوفيرين-N (CV-N) المبادل بالمجال ولمراقبة التفاعلات بين الببتيدات المانوسيلية وموقع الارتباط عالي التقارب ل CV-N. تم الإبلاغ عن طفرات غلاف الفيروس gp120 و HA و Ebola glycoprotein (GP) 1,2 لربط كل من مواقع الربط عالية ومنخفضة التقارب على CVN2 الثنائي. يرتبط ببتيد HA ثنائي المانوسيلات أيضا في موقعي الربط منخفض التقارب بجزيء مهندس من CVN2 ، والذي يحمل موقعا عالي التقارب لليجند المعني ويتحور ليحل محل رابطة ثاني كبريتيد مستقرة في جيب ربط الكربوهيدرات ، مما يؤكد الارتباط متعدد التكافؤ. يظهر ارتباط HA بموقع ربط عالي التقارب للجسم المضاد الزائف CVN2 عند ثابت تفكك (KD) يبلغ 275 نانومتر مما يزيد من تحييد فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) من خلال قلة القلة. يؤدي ربط عدد جسور ثاني كبريتيد في CVN2 المبادلة بالمجال ، والتي يتم تقليلها من 4 إلى 2 عن طريق استبدال السيستين في أزواج بقايا قطبية من حمض الجلوتاميك والأرجينين ، إلى تقليل تقارب الارتباط ب HA. من بين أقوى التفاعلات ، يرتبط الإيبولا GP1,2 ب CVN2 مع موقعين ملزمين عالي التقارب في النطاق النانوي السفلي باستخدام غلاف الجليكان بدون مجال عبر الغشاء. في هذه الدراسة ، يتم قياس ارتباط CV-N أحادي متعدد الأنواع بفيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) سبايك (S) بروتين سكري عند K D = 18.6 μM مقارنة ب nanomolar KD لتلك المسامير الفيروسية الأخرى ، وعبر مجال ربط المستقبلات في نطاق منتصف μ المولي.
Introduction
يتم تحفيز النشاط المضاد للفيروسات المرتبط ب Tetherin بواسطة α الإنترفيرون ، وهو يشتمل على حبال قائمة على البروتين ، مما يؤدي إلى الاحتفاظ بالفيروسات المشكلة بالكامل على أسطح الخلايا المصابة1. لا تزال ضرورة غليكوزيل التيثرين في تثبيط إطلاق الفيروس غير مؤكدة ، مما يعني أهمية أنماط الجليكوزيل على الجليكان المعبر عنه بشكل مؤتلف للدراسات المختبرية 1,2 ، والتي تعتمد على تشكيل (في حالة فيروس الأنفلونزا) الأنفلونزا المعبر عنها سطحيا هيماغلوتينين HA 3,4 . وقد لوحظ أن تعديل قليل السكاريد المربوط بالجليكوزيل المرتبط ب N يكفي لتقييد إطلاق فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1بوساطة التيثرين 2 ، بينما يلعب dimerization دورا أساسيا في منع إطلاق الفيروس ، وبالتالي إشراك المجال عبر الغشاء أو مرساة جليكوزيل فوسفاتيديل إينوسيتول (GPI) لربط الفيروسات الناشئة5 . يتم وصف الميزات الفريدة للحبل البشري والفئران لمنع العديد من الفيروسات المغلفة والفيروسات القهقرية والفيروسات الخيطية. BST-2 / tetherin هو بروتين مضاد للفيروسات يمكن تحريضه بواسطة الإنترفيرون للمناعة الفطرية 1,6 ، ويعمل مع نشاط مضاد للفيروسات واسع الطيف ويتم معاداته بواسطة البروتينات السكرية المغلفة5 إما لنقل التيثرين أو تعطيل بنية التيثرين 6. على سبيل المثال ، يعرف البروتين السكري المغلف المعبر عنه سطحيا HA والنورامينيداز على فيروس الأنفلونزا A بمعاداة التيثرين بطريقة خاصة بالسلالة7 ، مما يسهل التعرف على مواقع ربط مستقبلات المضيف8. تتم دراسة الأجسام المضادة التي تستهدف الجليكان في القياس المتكافئ لتفاعلاتها مع دروع الجليكان سريعة التخصيص على HA ، مما يؤدي إلى تقارب ملزم بالنوعين الفرعيين4 من الأنفلونزا A H3N2 و H1N1.
لتوضيح آليات الربط بين العوامل المضادة للفيروسات وطفرات غلاف الفيروس ، أي روابط الكربوهيدرات ، والطرق المناعية والطيفية التكميلية ، يتم تصنيع شقوق أحادية وثنائية وثلاثية مانوز كيميائيا. يتم إنشاء الببتيدات المانوسيلية عن طريق أزيدو جليكوزيل من جليكوزيل {بيتا}-بيراسيتات إلى 1،2-trans glycosyl azidesتحويل 9 ، مما يحاكي الجلوكوزامين N-acetyl الموجود عادة وقليل السكاريد عالي المانوز على سطح الفيروسات التي تهدد الحياة. تستخدم الإيزوكوسترات الحيوية التريازول لتقليد الروابط التي تشكل بقايا مانوسيلات من ببتيد HA10 وتسهيل التفاعلات الخاصة بالموقع مع مشتقات CV-N المضادة للفيروسات حول بقعة الجليكوزيل الثانية المرتبطة ب N على مجال رأس HA (قمة HA مع 4 جليكان مرتبط ب N N54 ، N97 ، N181 ، N301) 8،11،12 . أظهرت التفاعلات بين حمض الجلوتاميك (Glu) والأرجينين (Arg) وثنائي القطب الحلزوني الناتج استقرارا جيدا لكل من الببتيدات النموذجية والبروتينات ولكن يتم تصورها باستخدام SPR. إذا ما قورنت بالتعرف على موقع جليكوزيل واحد مركب كيميائيا على HA10 عن طريق تثبيط ارتباط المستقبلات مباشرة على شقوق الجليكان ، فإن التقارب الأعلى لهيكل Fc المتحور المكون من أربعة مواقع لمستقبلاته يظهر أنه يستنبط وظائف المستجيب في الجسم الحي ، مما يكشف عن التركيب غير ذي الصلة للجليكان المرتبط ب N المرتبط بمتحولة Fc ليتم تحديده ميكانيكيا13.
يعرض CV-N نشاطا مضادا للفيروسات ضد فيروس نقص المناعة البشرية 14،15 والإنفلونزا16 وفيروس الإيبولا ، والذي يتم بوساطة الارتباط النانوي بتعديلات قليل السكاريد عالية المانوز على بروتينات سبايك المغلف 12،17،18،19. تم تحديد ارتباط الأنفلونزا HA بموقع واحد عالي التقارب لربط الكربوهيدرات (H) في CV-N أو اثنين من Hs في CVN2 ثنائي الارتباط تساهميا للحصول على ثوابت تفكك التوازن (K D) = 5.7 نانومتر (الشكل 1A) و KD = 2.7 نانومتر ، على التوالي. يحتوي كل من CV-N و CVN2 على واحد أو اثنين من مواقع ربط الكربوهيدرات منخفضة التقارب (L) s12،17،20،21. يرتبط الإيبولا GP1,2 ب 2H من CVN2 مع تقارب في النطاق النانوي السفلي (KD = 26 نانومتر). يظهر ارتباط CV-N WT بالإيبولا GP1,2 و HA صلات من K D = 34 نانومتر إلى KD = 5.7 نانومتر (A / New York / 55/04)12. الليكتين ، مثل CV-N ، الذي يستهدف على وجه التحديد جليكان عالي المانوز على الأظرف الفيروسية ، يمنع تكاثر فيروس التهاب الكبد C ، و SARS-CoV ، وفيروس الهربس ، وفيروس ماربورغ ، وفيروس الحصبة22.
تمت دراسة جزيء CV-N الصغير بدقة لأكثر من 20 عاما لأنه يعمل على ربط مجموعة واسعة من الفيروسات لمنع دخول الفيروس16,18. تشير التحليلات الهيكلية ومقايسات تقارب الربط إلى الربط المتقاطع لاثنين من Ls في ثنائي CVN2 المبادل بالمجال عن طريق الارتباط ثنائي التكافؤ في نطاق micromolar لتعزيز الحساسية للبروتينات السكرية المغلفة الفيروسية10,19. يتكون الارتباط الانتقائي ل Manα1-2Manα على أذرع Man(8) D1D3 و Man(9) من موقعين ملزمين لهما صلات مختلفة يقعان على بروتومرات البروتينالمعاكسة 20 ، وبالتالي الوصول إلى تقارب الارتباط النانوي (الشكل 1B). وبالتالي ، يعتبر CVN2 جسما مضادا زائفا فيما يتعلق بتطبيقه لربط الحواتم على فيروس نقص المناعة البشرية gp120 ، على غرار الأجسام المضادة المعادلة للفيروس17. هنا ، يهتم المؤلف بالتحقيق في الارتباط المحتمل ل CVN2 بارتفاع SARS-CoV-2 عبر مجال ربط المستقبلات (RBD). تؤدي منحنيات الربط للإنزيم البشري المحول للأنجيوتنسين (ACE) -2 مع SARS-CoV-2 RBD إلى KD = 4.7 نانومتر لهذا التفاعل المرتبط بيولوجيا23.
على النقيض من ذلك ، تتعرف فئات الغلوبولين المناعي المختارة على أنماط البروتين الهيكلية المحددة والمتسقة ، والتي تضفي ركيزة لنضج التقارب في مناطق HA المثبتة بالغشاء24. يظهر CV-N نشاطا قويا للغاية في جميع فيروسات الأنفلونزا A و B تقريبا16 ، وهو عامل مضاد للفيروسات على نطاق واسع. معرفتنا غير مكتملة حول موقع الحلقات المستهدفة على جذع HA1 و HA2 والتي ربما تتضمن هياكل epitopic لاستهداف الجليكان بواسطة أجسام مضادة شديدة التحييد وبالمقارنة مع ربط الليكتين25.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لمقايسة ربط SPR ل CV-N إلى طفرات غلاف الفيروس. (أ) مقايسة SPR لربط CV-N بالليجند: بروتين HA كامل الطول (90 كيلو دالتون). مجموعة البيانات الحركية (5120 ، 2560 ، 1280 ، 640 ، 320 ، 160 ، 80 ، 40 ، 20 ، 10 ، 5 ، 2.5 ، 0 نانومتر) تظهر الارتباط المرجعي المزدوج في الوقت الفعلي بالأنفلونزا HA A / New-York / 55/04 (H3N2). (B) ارتباط متغير CVN2L0 V2 بربط DM المجمد ضمن نطاق تركيز يتراوح بين 500 نانومتر و 16 ميكرومتر. التسلسل: يتم تمييز بقايا L باللون الأصفر. يتم تمييز بقايا H باللون الرمادي. E58 و R73 هما بديل للسيستين في البروتين البري ويجعلان V2 طية بروتين مستقرة مع ثلاثة بدلا من أربعة روابط ثاني كبريتيد الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
في حين أن درع الجليكان الموجود على الجزء العلوي من HA البعيد الغشائي يحفز ارتباطا عالي التقارب ب CV-N 12 ، فقد لوحظ ارتباط CVN2 ب HA المجاور لجسر ثاني كبريتيد الجزء العلوي من HA في مواقعه منخفضة التقارب10,12. يتم تحديد التفاعلات القطبية المختلفة ومواقع التفاعل في ربط الكربوهيدرات بواسطة CV-N. يتم التحقق من هذه التفاعلات عن طريق توليد متغيرات خروج المغلوب في موقع الربط لربط صلات الربط في السيليكو المتوقعجليكوزيل 12. وبالتالي ، يهدف المشروع إلى مقارنة ببتيدات HA التي تم اختبارها كيميائيا سابقا في تقارب وخصوصية ملزمة مع تسلسلات ببتيد قصيرة من طفرات 2019-nCoV المرتبطة بالسارس و SARS-CoV-2 ، والتي تحدث بشكل طبيعي معدلة بواسطة عدد صغير من مواقع الجليكوزيل المختلفة المرتبطة ب N والجليكوزيل المرتبط ب O. باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد وفحوصات الربط ، أبلغ بينتو وزملاؤه عن جسم مضاد أحادي النسيلة ، S309 ، من المحتمل أن يتعرف على حاتم على بروتين سبايك SARS-CoV-2 يحتوي على جليكان محفوظ داخل الجنس الفرعي لفيروس Sarbecovirus ، دون التنافس مع مرفق المستقبل26. يصف بروتوكول هذه الدراسة مدى أهمية تصميم متغيرات CV-N والتعبير عنها وتوصيفها لدراسة كيفية ارتباط CV-N و CVN2 بالبروتينات الغليكوزيلاتية والببتيدات الاصطناعية باستخدام تقنية SPR10,12.
يتم التعبير عن ثنائي التدوير المرتبط بالترادف CVN2L027 ومتغيرات موقع الربط (V2-V5) بشكل مؤتلف والمتغيرات مع بدائل رابطة ثاني كبريتيد (C58E و C73R) (الشكل 2 أ). أيضا ، يتم إعداد طفرة مع طفرة أحادية النقطة E41A لأن هذا الموقف ينظر إليه على أنه بقايا تلامس بين الجزيئات. هذا الطفرة هي جزيء آخر مثير للاهتمام لقياسات ربط SPR بين الليكتين والسكريات قليلة السكاريد عالية المانوز التي تفك رموز مجالات الربط وتسمح بالمقارنة مع الشكل الثنائي. يظهر الهيكل البلوري المبدل المجال ل CVN2 رابطا مرنا يمتد بين 49 و 54 بقايا. يمكن أن يستمر المجالان في التحرك حول المفصلة كأجسام صلبة ، ويطوران إما مونومر من خلال تفاعلات المجال داخل الجزيئات (المجال A – بقايا 1-39 ؛ 90-101- مع المجال B – بقايا 40-89) أو ثنائي عن طريق تبديل المجال بين الجزيئات [المجال A (من المونومر الأول) مع المجال B (من الثاني) ، والمجال B (من المونومر الأول) مع المجال A (من النسخة الثانية)]. لا توجد تفاعلات وثيقة بين المجالين A و B للأوليين ، باستثناء Glu4128. يمكن تطوير جين CV-N باستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتكررة مع أوليغوس29 المركب 40 مير ثم يتم استنساخه في مواقع NdeI و BamHI ل pET11a للتحويل (التثقيب الكهربائي) إلى خلايا كهروبيئية كما وصفها Keeffe، J.R.27. يتضمن البروتين ، الذي يستخدم لتحقيق البنية البلورية المعنية (PDB ID 3S3Y) ، علامة تنقية N-terminal 6-histidine متبوعة بموقع انقسام البروتياز العامل Xa. يستخدم الطفرات الموجهة للموقع لعمل طفرات نقطية ، وتبديل الكودونات ، وإدخال أو حذف قواعد أو كودونات مفردة أو متعددة لتبادل الأحماض الأمينية. توفر هذه التحولات نظرة ثاقبة لا تقدر بثمن في وظيفة البروتين وهيكله. تمت دراسة CV-N و CVN2 و CVN3 المعبر عنها وتنقيتها بشكل جيد من الناحية الفيزيائية الحيوية20،21،27 ، وهي رخيصة الإنتاج ، وبالتالي تستخدم لتوصيف مقايسات الربط بالجليكان المثبت على رقائق مستشعر SPR. يوفر مقايسة الممتز المناعي التقليدي المرتبط بالإنزيم (ELISA) قابلية استنساخ أقل فيما يتعلق بتقنية تجميد روابط الجليكان ويحول الارتباط في الوقت الفعلي لمتغيرات موقع الربط المختلفة ، والتي تظهر ل SPR ، إلى مقايسات نقطة النهاية.
يتم التعبير عن متغير التقارب المرتبط CVN2L0-V2 (طية سليمة من CV-N المتجانس مع استبدال جسر ثاني كبريتيد10) بعلامة His-tag في الإشريكية القولونية (E. coli) ، ويتم تنقيتها فوق عمود Ni-NTA باستخدام كروماتوغرافيا التقارب واختبارها للارتباط ب HA (H3N2) ، ببتيد HA-أحادي المانوسيلات وببتيد HA-ثنائي المانوسيلات باستخدام SPR. الببتيدات المانوسيلية كيميائيا ، أو بروتين HA و S ، كلها روابط وأمين مقترنة بسطح الرقاقة المحبة للماء عن طريق الإسترات التفاعلية أو هندسة بروتين البيوتين ستربتافيدين. يتم تطبيق نفس الإجراء الخاص بالتشغيل المتسلسل على تلك الروابط ، وحقن التخفيفات المختلفة ل CV-N ومتغيرات CV-N (و CVN2) للحصول على معلومات حركية لتحليلات التفاعل الجزيئي كما هو موضح أدناه30. تستخدم رقاقة مستشعر SPR المجمدة RBD لدراسات الربط على ببتيدات CV-N إلى S ، وتتم مقارنة الصلات بربط SARS-CoV-2 مع ACE2 البشري.
Protocol
Representative Results
Discussion
يرتبط تقارب ربط CV-N بعدد مواقع الربط الوظيفية [2H على المجالات B ، و 2L على المجال (المجالات) A عند هندستها كثنائي مبدل بالمجال]. يتم التعبير عن متغير مع تقارب ربط متغير (CVN2L0-V2 ، طية مستقرة متجانسة من CV-N تتكون من ضربة قاضية لجسر ثاني كبريتيد) في الإشريكية القولونية ، وتنقيتها ، واختبارها إيجا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلف بالدكتور كريستيان ديرنتل من قسم التكنولوجيا الحيوية وعلم الأحياء الدقيقة في TU Wien وقسم الطب الثالث ، قسم أمراض الكلى وغسيل الكلى في جامعة فيينا الطبية ، وخاصة الدكتور ماركوس وهرمان للدعم الفني والعلمي. تم دعم تعبير البروتين في خلايا الثدييات من قبل قسم التكنولوجيا الحيوية في جامعة الموارد الطبيعية وعلوم الحياة (BOKU) في فيينا. تريد الكاتبة أن تعرب عن تقديرها العميق للدكتور نيكو دانكبار من XanTec bioanalytics في دوسلدورف ، ألمانيا ، لإجراء مناقشات علمية مفيدة حول إجراء فحوصات ربط SPR.
Materials
| Äkta primeplus | Cytiva | ||
| Amicon tubes | Merck | C7715 | |
| Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
| Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
| Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
| Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
| Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
| Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
| Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
| DTT | Merck | DTT-RO | |
| EDC | Merck | 39391 | |
| EDTA | Merck | E9884 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| Glycine HCl | Merck | 55097 | |
| HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
| Imidazole | Merck | I2399 | |
| IPTG | Merck | I6758 | |
| Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
| LB agar | Merck | 52062 | |
| LB agar | Merck | 19344 | |
| LB Lennox | Merck | L3022 | |
| Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
| Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
| NaH2P04 | Merck | S0751 | |
| NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| NaOH | Merck | S5881 | |
| NHS | Merck | 130672 | |
| NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
| PBS | Merck | 806552 | |
| PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
| Peptone | Merck | 70171 | |
| pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
| Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
| Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
| Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
| SDS | Merck | 11667289001 | |
| Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
| Sodim chloride | Merck | S9888 | |
| Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
| SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
| SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
| Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
| TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
| Triton-X100 | Merck | T8787 | |
| Tryptone | Merck | 93657 | |
| Tween20 | Merck | P1379 | |
| Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
| X-gal | Merck | XGAL-RO | |
| XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
| Yeast extract | Merck | Y1625 |
References
- Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
- Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
- Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
- Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
- Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
- Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
- Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
- Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
- Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
- Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
- Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
- Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
- Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
- Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
- Bolmstedt, A. J., O’Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
- O’Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
- Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
- Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
- Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
- Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
- Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
- Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
- Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
- Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
- Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
- Fischer, M. J. E., Mol, N., Fischer, M. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 627, (2010).
- Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , 532-535 (2005).
- . QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to (2005)
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- . Expasy.org Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022)
- Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
- Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
- . Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28 Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022)
- Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. 5, 97-141 (2007).
- . Method Development Notes Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022)
- Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chimie. 16 (26), 7803-7812 (2010).
- Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
- Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).
