प्राथमिक माउस रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम कोशिकाओं का अलगाव
Summary
यह पांडुलिपि चरणबद्ध तरीके से माउस आंखों से रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। प्रोटोकॉल में माउस आंखों के एन्यूक्लिएशन और विच्छेदन शामिल हैं, इसके बाद आरपीई कोशिकाओं के अलगाव, बोने और संवर्धन शामिल हैं।
Abstract
रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) परत फोटोरिसेप्टर्स के ठीक पीछे स्थित है और एक जटिल चयापचय प्रणाली को आश्रय देती है जो फोटोरिसेप्टर्स के कार्य को बनाए रखने में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इस प्रकार, सामान्य दृष्टि को बनाए रखने के लिए आरपीई संरचना और कार्य आवश्यक हैं। यह पांडुलिपि प्राथमिक माउस आरपीई सेल अलगाव के लिए एक स्थापित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है। आरपीई अलगाव ओकुलर विकारों के विभिन्न माउस मॉडल में आरपीई पैथोलॉजी अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए एक महान उपकरण है। इसके अलावा, आरपीई अलगाव जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से अलग प्राथमिक माउस आरपीई कोशिकाओं की तुलना करने में मदद कर सकता है, साथ ही दवाओं का परीक्षण कर सकता है जो दृश्य विकारों के लिए चिकित्सा के विकास में तेजी ला सकते हैं। पांडुलिपि एक चरण-दर-चरण आरपीई अलगाव प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है; पूरी प्रक्रिया, एन्यूक्लिएशन से लेकर बोने तक, लगभग 4 घंटे लगती है। मीडिया को बोने के बाद 5-7 दिनों के लिए नहीं बदला जाना चाहिए, ताकि बिना किसी गड़बड़ी के पृथक कोशिकाओं के विकास की अनुमति मिल सके। इस प्रक्रिया के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से कोशिकाओं में आकृति विज्ञान, रंजकता और विशिष्ट मार्करों की विशेषता होती है। कोशिकाओं को अधिकतम तीन या चार बार पारित किया जा सकता है।
Introduction
रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) कोशिकाएं कोरॉइड और तंत्रिका रेटिना के बीच स्थित होती हैं, जो घनाकार कोशिकाओं का एक साधारण मोनोलेयर बनाती हैं जो फोटोरिसेप्टर (पीआर) कोशिकाओं के पीछे स्थित होती हैं1. आरपीई पीआर कोशिकाओं के लिए एक स्वस्थ वातावरण बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, मुख्य रूप से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के अत्यधिक संचय को कम करके और परिणामस्वरूप ऑक्सीडेटिव क्षति1. आरपीई कोशिकाएं रेटिनोइड्स के रूपांतरण और भंडारण, बिखरे हुए प्रकाश, तरल पदार्थ और आयन परिवहन के अवशोषण और शेड पीआर बाहरी खंड झिल्ली 2,3 के फागोसाइटोसिस जैसे कई कार्यों की देखरेख करती हैं। फ़ंक्शन) में परिवर्तन रेटिनोपैथी के लिए अग्रणी उनके कार्य को खराब कर सकते हैं और यह कई ओकुलर विकारों द्वारा साझा की गई एक सामान्य विशेषता है4. कई ओकुलर रोग आरपीई कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और कार्य में परिवर्तन से जुड़े होते हैं, जिनमें कुछ आनुवंशिक रोग जैसे रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा, लेबर जन्मजात अमौरोसिस और अल्बिनिज्म 4,5,6, साथ ही उम्र से संबंधित ओकुलर विकार जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) 7,8 शामिल हैं। . मानव कोशिकाएं सबसे वांछनीय हैं, इस प्रकार आरपीई मोनोलेयर बनाने के लिए प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में आरपीई विकारों का अध्ययन करना आदर्श होगा। हालांकि, नैतिक मामलों और मानव दाताओं की सीमित उपलब्धता इस तथ्य के कारण है कि इनमें से अधिकांश विकार रुग्णता9 का कारण बनते हैं, लेकिन जरूरी नहीं कि मृत्यु दर10 हो, जिससे प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं के अलगाव को रोका जा सके। यह अमानवीय पशु दाताओं से आरपीई कोशिकाओं को संवर्धन एक पसंदीदा विकल्प बनाता है। कृन्तकों, विशेष रूप से चूहों, विभिन्न ओकुलर रोगों का अध्ययन करने के लिए एक महान मॉडल माना जाता है क्योंकि ट्रांसजेनिक तकनीक इन प्रजातियों में अधिक व्यापक रूप से स्थापित है11. भले ही सुसंस्कृत प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं का उपयोग कई फायदे प्रदान करता है, लेकिन कई मार्गों के लिए बढ़ती कोशिकाओं को बनाए रखना, या कोशिकाओं को संग्रहीत करना और पुन: उपयोग करना मुश्किल रहा है। इस प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा चूहों की उम्र है; आरपीई अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों को बहुत कम उम्र का होना चाहिए (18-21 दिन पुराना इष्टतम है) क्योंकि वयस्क चूहों11,12,13 से आरपीई कोशिकाओं को संस्कृति करना मुश्किल है। आरपीई कोशिकाओं को किसी भी उम्र में माउस आंखों से अलग किया जा सकता है, हालांकि चार सेल मार्ग केवल युवा चूहों (18-21 दिन पुराने) के साथ सफल थे। आरपीई कोशिकाओं में एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट रिसेप्टर्स (एनएमडीएआर) के विलोपन के साथ सी 57 बीएल 6 चूहों और ट्रांसजेनिक चूहों दोनों का उपयोग करके माउस रेटिना से आरपीई अलगाव, एएमडी14 के विकास और प्रगति पर ऊंचा एमिनो एसिड होमोसिस्टीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, पृथक प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं ने आरपीई कोशिकाओं14 में एनएमडीएआर के निषेध द्वारा एएमडी के लिए एक चिकित्सीय लक्ष्य का प्रस्ताव करने में मदद की। कुछ एनएमडीएआर ब्लॉकर्स हैं जो खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित हैं और वर्तमान में अल्जाइमर रोग (एडी) से संबंधित मध्यम से गंभीर भ्रम (मनोभ्रंश) के इलाज के लिए उपयोग किए जाते हैं, जैसे कि मेमेंटाइन16, जो एएमडी14 के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है। इसके अलावा, पृथक प्राथमिक माउस आरपीई कोशिकाओं का उपयोग भड़काऊ मार्करों का पता लगाने और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस (सीबीएस) का उपयोग करके एएमडी और एडी की होमोसिस्टीन-प्रेरित विशेषताओं के लिए एक अंतर्निहित तंत्र के रूप में सूजन के प्रस्तावित प्रेरण के लिए किया गया था, जो होमोसिस्टीन16,17 का उच्च स्तर प्रस्तुत करता है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग जंगली प्रकार सी 57 बीएल / 6 चूहों और ट्रांसजेनिक चूहों दोनों से आरपीई कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया था, जो आसानी से लागू और विश्वसनीय प्रोटोकॉल तक पहुंचने के लिए अन्य प्रकाशित अलगाव प्रोटोकॉल13,18,19 के सरलीकृत अनुकूलन के रूप में हमारी प्रयोगशाला में विकसित हुए थे। इस प्रोटोकॉल में कोई सेक्स वरीयता नहीं है। जबकि चूहों की उम्र अलगाव प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है, युवा, वृद्ध चूहों (18-21 दिन) और किसी भी उम्र में पुराने चूहों (12 महीने तक) का उपयोग आरपीई अलगाव के लिए किया गया था। हालांकि, हमने देखा कि युवा आयु वर्ग के चूहों से अलग आरपीई कोशिकाएं लंबे समय तक जीवित रहती थीं, और चार मार्ग तक प्रदर्शन किया जा सकता था। पुराने चूहों से पृथक आरपीई कोशिकाओं को एक या दो बार पारित किया जा सकता है, फिर वे सामान्य दर से बढ़ना बंद कर देंगे और अपने आकार को अधिक लम्बी (फाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं) में बदल देंगे। पिग्मेंटेशन का नुकसान और टिशू कल्चर प्लेट में आसंजन में कमी के बाद टुकड़ी भी देखी गई।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल माउस आंखों से आरपीई अलगाव के लिए एक रिपोर्ट, संशोधित और सरलीकृत विस्तृत प्रक्रिया है। प्रोटोकॉल में माउस आंखों से पृथक आरपीई कोशिकाओं के एन्यूक्लिएशन, विच्छेदन, संग्रह, बीजारोपण, स?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (एनईआई), राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (एनईआई) फंड आर01 ईवाई029751-04 द्वारा समर्थित किया गया था
Materials
| Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
| Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
| Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
| Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
| Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
| Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
| Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
References
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
- Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
- Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
- Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
- Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
- Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
- Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
- van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer’s disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
- Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
- Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020)
- Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
- Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
- Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).
