Standard membranfodringsanalyse til påvisning af Plasmodium falciparum-infektion i Anopheles mygvektorer

Summary

Standardmembranfodringsanalysen (SMFA) betragtes som guldstandarden til vurdering og identifikation af potentielle malariaforbindelser. Dette kunstige fodringssystem bruges til at inficere myg for yderligere at evaluere virkningerne af sådanne forbindelser på intensiteten og forekomsten af Plasmodium falciparum-parasitten .

Abstract

Malaria er fortsat en af de mest ødelæggende sygdomme på verdensplan, og til dato er den afrikanske region stadig ansvarlig for 94% af alle tilfælde på verdensplan. Denne parasitære sygdom kræver en protozoan parasit, en Anopheles mygvektor og en hvirveldyr vært. Anopheles-slægten omfatter mere end 500 arter, hvoraf 60 er kendt som vektorer af parasitten. Plasmodium-parasitslægten består af 250 arter, og 48 af disse er involveret i sygdomsoverførsel. Desuden har Plasmodium falciparum-parasitten bidraget til anslået 99,7% af malariatilfældene i Afrika syd for Sahara i de senere år.

Gametocytter udgør en del af parasitens seksuelle stadium og indtages af den kvindelige myg ved fodring på en inficeret menneskelig vært. Yderligere udvikling af parasitten i myggen forbedres af gunstige miljøforhold i myggens midgut. Her finder fusionen af de kvindelige og mandlige gameter sted, og de bevægelige ookineter stammer fra. Ookineterne kommer ind i myggens midgutepitel, og modne ookineter danner oocyster, som igen producerer bevægelige sporozoitter. Disse sporozoitter migrerer til myggens spytkirtler og injiceres, da en myg tager et blodmåltid.

Til lægemiddelopdagelsesformål blev myg kunstigt inficeret med gametocytinficeret blod i standardmembranfodringsanalysen (SMFA). For at opdage infektion i myggen og / eller for at vurdere effektiviteten af malariaforbindelser blev midguts af de kvindelige myg fjernet efter infektion og blev farvet med mercurochrome. Denne metode blev brugt til at forbedre den visuelle påvisning af oocyster under mikroskopet til nøjagtig bestemmelse af oocystprævalens og intensitet.

Introduction

Malaria, kendt som en af de mest ødelæggende sygdomme på verdensplan, udgør stadig en stor trussel mod flere lande – især dem i den afrikanske region – og bidrager til ca. 95% af tilfældene på verdensplan¹. Denne sygdom er forårsaget af en protozoisk parasit, og sammen med sin Anopheles mygvektor kan disse syndere forårsage stor skade på den menneskelige vært². Mere specifikt er falciparum-arterne af Plasmodium-parasitslægten ansvarlig for anslået 99% af malariatilfældene i Afrika syd for Sahara¹. Ud over dette kunne flere store Anopheles mygvektorer (herunder An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. og An. funestus Giles) skyldes mere end 95% af parasitoverførsel globalt 3,4,5,6,7,8 . For at det ideelle parasitvektorkammeratskab kan etableres, skal mygvektoren være modtagelig for parasitten og være i stand til at overføre den⁹. Desuden skal både vektoren og parasitten overvinde fysiske barrierer for at danne den perfekte infektiøse kombination – mygvektoren skal være i stand til at opretholde parasitudvikling, og parasitten skal have evnen til at overvinde værtsens forsvarsmekanismer^10,11.

Gametocytter, det seksuelle stadium af P. falciparum-parasitten, spiller en afgørende rolle i forbindelsen mellem vektor- og parasitpartnerne¹². Seksuel udvikling finder sted in vivo, og gametocytogenese beskriver processen med differentiering af modne gametocytter til bevægelige mandlige mikrogameter og kvindelige makrogameter¹³. En anden proces, der finder sted i myggen, er exflagellation – den proces, hvor den mandlige gametocyt omdannes til gameter og kommer ud af de røde blodlegemer, der optages under et blodmåltid¹¹. Exflagellationsprocessen foreslås yderligere at blive forbedret ved en gunstig ændring i miljøet i myggen midgut¹⁴. Efter exflagellation dannes en zygote ved fusion af de mandlige og kvindelige gameter¹³. Fra zygoten opstår en bevægelig ookinete og bevæger sig fra blodmelet til epitelet af myggen midgut¹³. Her modnes ookineten, og der dannes en oocyst, som igen producerer bevægelige sporozoitter^13,15. Sporozoitterne migrerer derefter til myggens spytkirtler, og da myggen tager et blodmåltid fra sin vært, injiceres disse sporozoitter i værtsens blodbane¹⁵.

Malariakontrolinterventioner, der kombinerer vektorkontrolstrategier og brugen af effektive malarialægemidler, er blevet afgørende for bekæmpelsen af denne sygdom¹⁵. Med en stigning i parasit- og mygresistens øges behovet for identifikation af nye malariaforbindelser¹⁶. Derfor er in vivo-evalueringen af transmissionsblokerende forbindelser vigtig¹⁶. Efter udviklingen af sådanne effektive transmissionsblokerende lægemidler er SMFA blevet brugt til at vurdere, om disse forbindelser hæmmer den seksuelle udvikling af P. falciparum i Anopheles-myggen ^17,18,19. Dette assay har fået anerkendelse siden 1970-1980’erne som guldstandarden til evaluering af transmissionsblokering^20,21. Dette assay giver et billigere alternativ end andre assays såsom RT-qPCR, som kræver specialudstyr. Desuden er der ikke behov for patienter til at udføre forsøgene. Dette assay involverer også tilvejebringelse af gametocytinduceret blod til kvindelige myg, som derefter dissekeres for at vurdere, om oocystudvikling er til stede²¹. Dette muliggør gametocytkvantificering og påvisning af deformerede oocyster på grund af forbindelserne²². For at en forbindelse skal klassificeres som effektiv, skal prævalensen (andelen af myg, der har mindst en oocyst i midgut) og antallet af oocyster (intensitet) i myggen midgut evalueres for at vurdere infektionsinhibering 17,21,22.

Protocol

Se figur 1 for en illustration af protokollen. Etisk godkendelse blev opnået fra University of Pretoria Health Sciences Ethics Committee (506/2018) til tilbagetrækning og brug af humant blod. 1. Gametocytkultur BEMÆRK: Før oprettelsen af SMFA blev der udarbejdet en gametocytkultur ved University of Pretoria (se Reader et al.22 for den komplette protokol). Forbered en gametocytkultur…

Representative Results

Det samlede antal kontrolprøver, der blev dissekeret, var 47, med en gennemsnitlig prævalens på 89% og en intensitet på 9,5 oocyster pr. midgut (tabel 1, som tidligere offentliggjort22). For forbindelsen MMV1581558 nåede prøvestørrelsen i alt 42 prøver med en 36% oocystprævalens og en gennemsnitlig intensitet på 1,5 oocyster. Dette viser en reduktion i oocystprævalensen på 58% og en TRA på 82% på tværs af alle tre biologiske replikater (tabel 1).</p…

Discussion

For at denne protokol skal udføres med succes, skal der lægges vægt på hvert trin, selvom det kan være en kedelig og besværlig proces. Et af de vigtigste trin er at sikre, at gametocytkulturen er af god kvalitet, og at den består af modne gametocytter med det korrekte forhold mellem mand og kvinde, inden SMFA^23,24 startes. Under SMFA er det også afgørende at opretholde gametocytkulturen ved den korrekte temperatur for at forhindre mandlige gameter i at u…

Materials

Bovine intestine/	Butchery
Compound MMV1581558	MMV		Pandemic response box
Dissecting needles	WRIM		Custom made
falcon tube	Lasec
Glass feeders	Glastechniek Peter Coelen B.V.
Graphpad Prism (8.3.0)	Graphpad
Mercurochrome	Merck (Sigma-Aldrich)	129-16-8
Microscope slides	Merch (Sigma-Aldrich)	S8902
Parafilm	Cleansafe
PBS tablets	ThermoFisher Scientific	BP2944
Perspex biosafety cabinet	Wits University		Made by the contractors at Wits
Plastic cups (350 mL)	Plastic Land