ハマダラカ媒介動物における熱帯熱マラリア原虫感染の検出のための標準的な膜摂食アッセイ
Summary
標準的な膜供給アッセイ(SMFA)は、潜在的な抗マラリア化合物の評価と同定のためのゴールドスタンダードと見なされています。この人工給餌システムは、熱帯 熱 マラリア原虫の強度と有病率に対するそのような化合物の影響をさらに評価するために蚊に感染するために使用されます。
Abstract
マラリアは依然として世界で最も壊滅的な病気の1つであり、今日まで、アフリカ地域は依然として世界の全症例の94%を占めています。この寄生虫症には、原虫寄生虫、 ハマダラカ の蚊媒介動物、および脊椎動物の宿主が必要です。 ハマダラカ 属は500種以上で構成され、そのうち60種は寄生虫のベクターとして知られています。 マラリア 原虫属は250種で構成され、そのうち48種が病気の伝染に関与しています。さらに、熱帯 熱 マラリア原虫は、近年、サハラ以南のアフリカにおけるマラリア症例の推定99.7%に貢献しています。
配偶子細胞は寄生虫の性段階の一部を形成し、感染したヒト宿主に摂食すると雌の蚊によって摂取される。蚊内の寄生虫のさらなる発達は、蚊の中腸内の好ましい環境条件によって促進される。ここでは、女性と男性の配偶子の融合が起こり、運動性のオキネテスが始まります。オキネテスは蚊の中腸上皮に入り、成熟したオキネテスはオーシストを形成し、それが次に運動性スポロゾイトを生成します。これらのスポロゾイトは蚊の唾液腺に移動し、蚊が血の食事をとるときに注射されます。
創薬目的で、蚊は標準的な膜摂食アッセイ(SMFA)で配偶子細胞に感染した血液に人工的に感染しました。蚊の感染を検出するため、および/または抗マラリア化合物の有効性を評価するために、雌の蚊の中腸を感染後に除去し、マーキュロクロムで染色しました。この方法は、オーシストの有病率と強度を正確に決定するために、顕微鏡下でのオーシストの視覚的検出を強化するために使用されました。
Introduction
世界で最も破壊的な病気の1つとして知られているマラリアは、依然としていくつかの国、特にアフリカ地域内の国に大きな脅威をもたらし、世界中の症例の約95%を占めています1。この病気は原虫寄生虫によって引き起こされ、そのハマダラカの蚊媒介動物と一緒に、これらの犯人は人間の宿主に大きな害を及ぼす可能性があります2。より具体的には、熱帯熱マラリア原虫属の熱帯熱マラリア種は、サハラ以南のアフリカのマラリア症例の推定99%を占めています1。これに加えて、いくつかの主要なハマダラカ媒介動物(An. gambiae Giles、An. arabiensis Patton、An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n.、An. funestus Gilesを含む)は、世界の寄生虫伝播の95%以上が原因である可能性があります3,4,5,6,7,8。.理想的な寄生虫とベクターの交際が確立されるためには、蚊のベクターは寄生虫の影響を受けやすく、それを伝達できる必要があります9。さらに、ベクターと寄生虫の両方が物理的な障壁を克服して完全な感染の組み合わせを形成する必要があります-蚊のベクターは寄生虫の発生を維持できる必要があり、寄生虫は宿主の防御メカニズムを克服する能力を持っている必要があります10,11。
熱帯熱マラリア原虫の性段階である配偶子細胞は、ベクターと寄生虫のパートナーをつなぐ上で重要な役割を果たします12。性的発達はin vivoで起こり、配偶子細胞形成は成熟配偶子細胞が運動性の雄性微小配偶子および雌性大配偶子に分化する過程を説明する13。蚊の中で起こる別のプロセスは、鞭打ちです-その間に雄の配偶細胞が配偶子に変化し、血の食事の間に取り込まれた赤血球から出現するプロセス11。この榴散プロセスは、蚊の中腸14の環境の好ましい変化によって増強されることがさらに示唆される。鞭毛後、接合子は男性と女性の配偶子の融合によって形成されます13。接合子から、運動性のオキネテが発生し、血粉から蚊の中腸13の上皮に移動する。ここで、オキネテが成熟し、オーシストが形成され、それが次に運動性スポロゾイトを生成する13,15。その後、スポロゾイトは蚊の唾液腺に移動し、蚊が宿主から血の食事を奪うと、これらのスポロゾイトは宿主の血流に注入されます15。
ベクター制御戦略と効果的な抗マラリア薬の使用を組み合わせたマラリア制御介入は、この病気と戦う上で重要になっています15。寄生虫および蚊の抵抗性の増加に伴い、新規抗マラリア化合物の同定の緊急性が高まっています16。したがって、透過遮断化合物のin vivo評価には重要である16。このような効果的な伝達遮断薬の開発後、SMFAは、これらの化合物がハマダラカの熱帯熱マラリア原虫の性的発達を阻害するかどうかを評価するために使用されてきました17,18,19。このアッセイは、1970〜1980年代から、透過遮断を評価するためのゴールドスタンダードとして認識されています20,21。このアッセイは、特殊な装置を必要とするRT-qPCRなどの他のアッセイよりも安価な代替手段を提供します。さらに、実験を実行するために患者は必要ありません。このアッセイはまた、配偶子細胞誘導血液を雌の蚊に供給することを含み、次いで、オーシスト発生が存在するかどうかを評価するために解剖される21。これにより、配偶子細胞の定量および化合物22のために変形したオーシストの検出が可能になります。化合物が有効であると分類されるためには、感染阻害を評価するために、蚊の中腸における有病率(少なくとも1つのオーシストを保有する蚊の割合)および蚊の中腸におけるオーシストの数(強度)を評価しなければならない17,21,22。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルを正常に実行するには、面倒で面倒なプロセスであっても、各ステップに注意を払う必要があります。最も重要なステップの1つは、SMFA23,24を開始する前に、配偶子細胞培養が良質であり、正しい雄:雌比の成熟配偶細胞で構成されていることを確認することです。SMFAの間、配偶子細胞培養を正しい温度に維持して、雄の配偶子が蚊?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は教授に感謝したいと思います。プレトリア大学の持続可能なマラリア対策研究所生化学、遺伝学、微生物学部のリン・マリ・バークホルツとジャネット・リーダー博士が配偶子細胞培養の培養と供給を担当しました。寄生虫株は後者の部門から入手した(この出版物の一部ではない)。科学イノベーション省(DSI)および国立研究財団(NRF)。南アフリカ研究議長イニシアチブ(UID 64763からLKおよびUID 84627からLMB);NRF実践コミュニティ(UID 110666 LMBおよびLK);南アフリカ医学研究評議会の戦略的ヘルスイノベーションパートナーシップ(SHIP)も、DSIからの資金提供で認められています。
Materials
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
References
- World Malaria Report. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240040496 (2021)
- Takken, W., Verhulst, N. O. Host preferences of blood feeding mosquitoes. Annual Review of Entomology. 58, 433-453 (2013).
- Gillies, M. T., Coetzee, M. Supplement to the Anophelinae of Africa south of the Sahara Afrotropical region. Publications of the South African Institute for Medical Research. 55, 1 (1987).
- Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa south of the Sahara. Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, (1968).
- Antonio-Nkondjio, C., et al. Complexity of the malaria vectorial system in Cameroon: contribution of secondary vectors to malaria transmission. Journal of Medical Entomology. 43, 1215-1221 (2006).
- Sinka, M. E., et al. The dominant Anopheles vectors of human malaria in Africa, Europe and the Middle East: occurrence data, distribution maps and bionomic précis. Parasites and Vectors. 3, 117 (2010).
- Coetzee, M., Hunt, R. H., Wilkerson, R., Della Torre, A., Coulibaly, M. B., Besansky, N. J. Anopheles coluzzii and Anopheles amharicus, new members of the Anopheles gambiae complex. Zootaxa. 3619, 246-274 (2013).
- Kyalo, D., Amratia, P., Mundia, C. W., Mbogo, C. M., Coetzee, M., Snow, R. W. A geo-coded inventory of anophelines in the Afrotropical Region south of the Sahara: 1898-2016. Wellcome Open Research. 2, 57 (2017).
- Cohuet, A., Harris, C., Robert, V., Fontenille, D. Evolutionary forces on Anopheles: What makes a malaria vector. Trends in Parasitology. 309, (2009).
- Weathersby, A. B. The role of the stomach wall in the exogenous development of Plasmodium gallinaceum as studies by means of haemocoel injections of susceptible and refractory mosquitoes. The Journal of Infectious Diseases. 91, 198-205 (1952).
- Ally, A. S. I., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. I. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. The Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Delves, M. J., et al. Male and female Plasmodium falciparum mature gametocytes show different responses to antimalarial drugs. American Society for Microbiology Journal. , (2013).
- Sinden, R. E. Sexual development of malarial parasites in their mosquito vector. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 75, (1981).
- Garcia, G. E., Wirtz, R. A., Barr, J. R., Woolfitt, A. Xanthurenic acid induces gametogenesis in Plasmodium, the malaria parasite. Journal of Biological Chemistry. 15, 12003-12005 (1998).
- Oaks, S. C., Mitchell, V. S., Pearson, G. W., et al. . Malaria: Obstacles and Opportunities. , (1991).
- Le Manach, C., et al. Identification and profiling of a novel Diazaspirol[3.4]octane chemical series active against multiple stages of the human malaria parasite Plasmodium falciparum and optimization efforts. Journal of Medicinal Chemistry. 64, 2291-2309 (2021).
- Cibulskis, R. E., et al. Malaria: global progress 2000-2015 and future challenges. Infect Diseases of Poverty. 5, 61 (2016).
- Smith, T. A., Chitnis, N., Briet, O. J., Tanner, M. Uses of mosquito-stage transmission-blocking vaccines against Plasmodium falciparum. Trends in Parasitology. 27, 190-196 (2011).
- Boyd, M. F., Boyd, M. F. Epidemiology: factors related to the definitive host. Malariology. , 608-697 (1949).
- Ponnudurai, T., van Gemert, G. J., Bensink, T., Lensen, A. H., Meuwissen, J. H. Transmission blockade of Plasmodium falciparum: its variability with gametocyte numbers and concentration of antibody. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine. 81, 491-493 (1987).
- Rutledge, L. C., Ward, R. A., Gould, D. J. Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder. Mosquito News. 24 (4), (1964).
- Reader, J., et al. Multistage and transmission-blocking targeted antimalarials discovered from the open-source MMV Pandemic Response Box. Nature Communications. 12, 269 (2021).
- Bousema, T., et al. Mosquito feeding assays for natural infections. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Churcher, T., et al. Measuring the blockade of malaria transmission – An analysis of the standard membrane feeding assay. International Journal for Parasitology. 42, 1037-1044 (2012).
- Medley, G. F., et al. Heterogeneity in patterns of malarial oocyst infections in the mosquito vector. Parasitology. 106, 441-449 (1993).
- Miura, K., et al. Transmission-blocking activity is determined by transmission reducing activity and number of control oocysts in Plasmodium falciparum standard membrane-feeding assay. Vaccine. 34, 4145-4151 (2016).
- Sattabongkot, J., Maneechai, N., Rosenberg, R. Plasmodium vivax: gametocyte infectivity of naturally infected Thai adults. Parasitology. 102 (01), 27-31 (1991).
- Vallejo, A. F., Garcia, J., Amado-Garavito, A. B., Arevalo-Herrera, M., Herrera, S. Plasmodium vivax gametocyte infectivity in sub-microscopic infections. Malaria Journal. 15 (1), 48 (2016).
- Ponnudurai, T., Lensen, A. H. W., van Gemert, G. J. A., Bolmer, M. G., Meuwissen, J. H. E. Feeding behavior and sporozoite ejection by infected Anopheles stephensi. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 85, 175-180 (1991).
- Miura, K., et al. Qualification of standard membrane-feeding assay with Plasmodium falciparum malaria and potential improvements for future assays. PLoS One. 8, 57909 (2013).
- Griffin, P., et al. Safety and reproducibility of a clinical trial system using induced blood stage Plasmodium vivax infection and its potential as a model to evaluate malaria transmission. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, 0005139 (2016).
- Delves, M. J., Sinden, R. E. A semi-automated method for counting fluorescent malaria oocysts increases the throughput of transmission blocking studies. Malaria Journal. 9, 35 (2010).
- vander Kolk, M., et al. Evaluation of the standard membrane feeding assay (SMFA) for the determination of malaria transmission-reducing activity using empirical data. Parasitology. 130, 13-22 (2005).
- van der Kolk, M., de Vlas, S. J., Sauerwein, R. W. Reduction and enhancement of Plasmodium falciparum transmission by endemic human sera. International Journal for Parasitology. 36, 1091-1095 (2006).
- Singh, M., et al. Plasmodium’s journey through the Anopheles mosquito: A comprehensive review. Biochimie. 181, 176-190 (2021).
- Vos, M. W., et al. A semi-automated luminescence based standard membrane feeding assay identifies novel small molecules that inhibit transmission of malaria parasites by mosquitoes. Scientific Reports. 5, 18704 (2015).
- Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (2017).
- Okell, L. C., Bousema, T., Griffin, J. T., Ouedraogo, A. L., Ghani, A. C., Drakeley, C. J. Factors determining the occurrence of submicroscopic malaria infections and their relevance for control. Nature Communications. 3, 1237 (2012).
- Pasay, C. J., et al. Piperaquine monotherapy of drug-susceptible Plasmodium falciparum infection results in rapid clearance of parasitemia but is followed by the appearance of gametocytemia. The Journal of Infectious Diseases. 214, 105-113 (2016).
- Stone, W. J., et al. A scalable assessment of Plasmodium falciparum transmission in the standard membrane-feeding assay, using transgenic parasites expressing green fluorescent protein-luciferase. The Journal of Infectious Diseases. 210, 1456-1463 (2014).
- Hasan, A. U., et al. Implementation of a novel PCR based method for detecting malaria parasites from naturally infected mosquitoes in Papua New Guinea. Malaria Journal. 8, 182 (2009).
- Stone, W. J., et al. The relevance and applicability of oocyst prevalence as a read-out for mosquito feeding assays. Scientific Reports. 3, 3418 (2013).
- Marquart, L., Baker, M., O’Rourke, P., McCarthy, J. S. Evaluating the pharmacodynamic effect of antimalarial drugs in clinical trials by quantitative PCR. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59, 4249-4259 (2015).
- McCarthy, J. S., et al. tolerability, pharmacokinetics, and activity of the novel long-acting antimalarial DSM265: a two-part first-in-human phase 1a/1b randomised study. TheLancet Infectious Diseases. 17, 626-635 (2017).
