Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas
Summary
Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.
Abstract
Co-culturas complexas de organoides com células imunes fornecem uma ferramenta versátil para interrogar as interações bidirecionais que sustentam o delicado equilíbrio da homeostase mucosa. Esses sistemas 3D e multicelulares oferecem um modelo reducionista para lidar com doenças multifatoriais e resolver dificuldades técnicas que surgem ao estudar tipos de células raras, como células linfoides inatas residentes em tecido (ILCs). Este artigo descreve um sistema murino que combina organoides intestinais pequenos e ilCs derivados do lic do tipo 1 (ILC1s) do intestino delgado, que podem ser facilmente estendidos a outras populações ILC ou imunológicas. Os ILCs são uma população residente em tecidos que é particularmente enriquecida na mucosa, onde promovem a homeostase e respondem rapidamente a danos ou infecções. Co-culturas organoides com ILCs já começaram a lançar luz sobre novos módulos de sinalização epitelial-imune no intestino, revelando como diferentes subconjuntos iLC impactam a integridade e regeneração da barreira epitelial intestinal. Este protocolo permitirá novas investigações sobre interações recíprocas entre células epiteliais e imunes, que têm o potencial de fornecer novas percepções sobre os mecanismos de homeostase mucosa e inflamação.
Introduction
A comunicação entre o epitélio intestinal e o sistema imunológico residente no intestino é central para a manutenção da homeostase intestinal1. As interrupções nessas interações estão associadas a doenças locais e sistêmicas, incluindo doença inflamatória intestinal (DIB) e cânceres gastrointestinais2. Um exemplo notável de um regulador crítico mais recentemente descrito de homeostase vem do estudo de células linfoides inatas (ILCs), que surgiram como atores-chave na paisagem imunológica intestinal3. ILCs são um grupo de células imunes heterogêneas inatas que regulam a homeostase intestinal e orquestram inflamação em grande parte através da sinalização mediada porcitocinas 4.
Os ILCs murinos são amplamente divididos em subtipos baseados nos perfis de fator de transcrição, receptor e citocina5. Os ILCs tipo 1, que incluem células citotóxicas do Natural Killer (NK) e ILCs tipo 1 (ILC1s) tipo 1, são definidos pela expressão do fator de transcrição (eomesodermina) Eomes e proteína t-box expressa em células T (T-bet)6, respectivamente, e citocinas secretas associadas à imunidade tipo 1 (TH1) auxiliar: interferon-γ (IFNγ) e fator de necrose tumoral (TNF), em resposta à interleucina (IL)-12, IL-15 e IL-187. Durante a homeostase, os ILC1s residentes em tecidos secretam o Fator transformador de crescimento β (TGF-β) para impulsionar a proliferação epitelial e a remodelação matricial8. IlCs tipo-2 (ILC2s) respondem principalmente à infecção por helminto por secreção de cytocinas associadas ao auxiliar T-2 (TH2): IL-4, IL-5, e IL-13, e são caracterizados pela expressão do receptor órfão retinóico relacionado ao ácido (ROR) α (ROR-α)9 e GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Em camundongos, iLC2s “inflamatórios” intestinais são ainda mais caracterizados pela expressão do receptor semelhante à lectina celular assassina (membro G subfamília 1, KLRG)13 onde respondem a células epiteliais derivadas il-2514,15. Finalmente, ILCs tipo 3, que incluem células indutoras de tecido linfoide e ILCs tipo 3 (ILC3s), dependem do fator de transcrição ROR-γt16, e agrupam-se em grupos que secretam tanto o Fator Estimulante da Colônia Macifáfica Granulocyte (GM-CSF), IL-17 ou IL-22 em resposta aos sinais locais il-1β e-2317. As células indutoras de tecido linfoide se aglomeram nas manchas de Peyer e são cruciais para o desenvolvimento desses órgãos linfoides secundários durante o desenvolvimento18, enquanto os ILC3s são o subtipo ilc mais abundante no intestino delgado de murina adulto. Um dos primeiros sistemas de cocultura organoide intestinal murina com ILC3s foi aproveitado para provocar o impacto da citocina IL-22 no Transdutor de Sinal e Ativador da Transcrição 3 (STAT-3) mediado leucina-rich Repeat Contendo G Protein Acoplada Receptor 5 (Lgr5)+ proliferação de células-tronco intestinais19, um poderoso exemplo de uma interação regenerativa ILC-epitelial. Os ILCs exibem a heterogeneidade de impressão entre os órgãos20,21 e exibem plasticidade entre subconjuntos em resposta à polarização das citocinas22. O que impulsiona essas impressões específicas do tecido e as diferenças de plasticidade, e qual o papel que desempenham em doenças crônicas como o IBD23, permanecem tópicos emocionantes que poderiam ser abordados usando co-culturas organoides.
Os organoides intestinais emergiram como um modelo bem sucedido e confiável para estudar o epitélio intestinal24,25. Estas são geradas por células-tronco epiteliais intestinais, ou criptas isoladas inteiras, que incluem células paneth como uma fonte endógena do Membro da Família Wnt 3A (Wnt3a). Essas estruturas 3D são mantidas em hidrogéis sintéticos26 ou em biomateriais que imitam a ápula basal de lamina, por exemplo, a Matriz Extracelular Basal (TBEM), e são ainda complementadas com fatores de crescimento que imitam o nicho circundante, mais notavelmente o Fator de Crescimento Epitelial (EGF), o Inibidor de Proteína Morfogenética Óssea (BMP) e um Lgr5-ligante e Wnt-agonista R-Spondin127 . Nessas condições, os organoides mantêm a polaridade epitelial apico-basal e recapitulam a estrutura cript-villi do epitélio intestinal com criptas de células-tronco que se diferenciam terminalmente em células absortivas e secretas no centro da organoide, que então se derramou no pseudolumen interno por anoikis28. Embora os organoides intestinais sozinhos tenham sido extremamente vantajosos como modelos reducionistas de desenvolvimento epitelial e dinâmicaisoladamente 29,30, eles têm um enorme potencial futuro para entender como esses comportamentos são regulados, influenciados ou mesmo interrompidos pelo compartimento imunológico.
No protocolo a seguir, é descrito um método de cocultura entre organoides intestinais murinas pequenas e iLC1s derivados da lamina propria, que foi recentemente usado para identificar como essa população diminui inesperadamente as assinaturas intestinais de inflamação e, em vez disso, contribui para o aumento da proliferação epitelial via TGF-β neste sistema8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve os métodos para estabelecer organoides do intestino delgado murina, isolando iLC1 raro minimizando a perda de linfócitos durante o protocolo de dissociação intestinal, e estabelecendo co-culturas entre esses dois compartimentos. Existem muitos passos para este protocolo, e embora alguns sejam específicos para iLC1s, essa abordagem pode ser aplicada a outros tipos de células imunes intestinais, e as configurações de co-cultura podem ser adaptadas modularmente para se adequar a questões ind…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.R. reconhece uma bolsa de doutorado da Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. reconhece uma bolsa de doutorado da Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. reconhece um doutorado do NIHR GSTT BRC. J.F.N. reconhece uma Bolsa Marie Skłodowska-Curie, uma bolsa do King’s Prize, uma bolsa do Fundo RCUK/UKRI RutherfordRI (MR/R024812/1) e um Prêmio semente em Ciência do Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Agradecemos também à equipe do núcleo de citometria de fluxo brc sediada no Hospital Guy. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 repórteres ratos foram um presente generoso de G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, França). Os ratos CD45.1 C57BL/6 foram gentilmente dados por T. Lawrence (King’s College London, Londres) e P. Barral (King’s College London, Londres).
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
References
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