Роза Бенгал-Опосредованная Фотодинамическая Терапия для ингибирования Candida albicans
Summary
Растущая заболеваемость лекарственно-устойчивыми Candida albicans является серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Антимикробная фотодинамическая терапия (aPDT) может предложить стратегию борьбы с лекарственно-устойчивыми грибковыми инфекциями. Настоящий протокол описывает опосредованную розой бенгальскую эффективность aPDT на штамме C. albicans in vitro с множественной лекарственной устойчивостью.
Abstract
Инвазивная инфекция Candida albicans является значительной оппортунистической грибковой инфекцией у людей, потому что она является одним из наиболее распространенных колонизаторов кишечника, рта, влагалища и кожи. Несмотря на доступность противогрибковых препаратов, смертность от инвазивного кандидоза остается ~50%. К сожалению, заболеваемость лекарственно-устойчивымИ C. albicans растет во всем мире. Антимикробная фотодинамическая терапия (aPDT) может предложить альтернативное или адъювантное лечение для ингибирования образования биопленки C. albicans и преодоления лекарственной устойчивости. Роза бенгальская (RB)-опосредованная aPDT показала эффективное уничтожение клеток бактерий и C. albicans. В данном исследовании описана эффективность RB-aPDT на C. albicans с множественной лекарственной устойчивостью. Самодельный зеленый светодиодный (LED) источник света предназначен для выравнивания с центром колодца 96-луночной пластины. Дрожжи инкубировали в колодцах с различными концентрациями RB и освещали различными колебаниями зеленого света. Эффекты уничтожения были проанализированы методом разбавления пластин. При оптимальном сочетании света и RB было достигнуто 3-логарифмическое торможение роста. Был сделан вывод о том, что RB-aPDT может потенциально ингибировать лекарственно-устойчивые C. albicans.
Introduction
C. albicans колонизируется в желудочно-кишечном тракте и мочеполовом тракте здоровых людей и может быть обнаружен как нормальная микробиота примерно у 50 процентов лиц1. Если между хозяином и патогеном создается дисбаланс, C. albicans способен вторгаться и вызывать заболевание. Инфекция может варьироваться от локальных инфекций слизистой оболочки до полиорганной недостаточности2. В многоцентровом обсервационном исследовании в США около половины изолятов пациентов с инвазивным кандидозом в период с 2009 по 2017 год составляют C. albicans3. Кандидемия может быть связана с высокими показателями заболеваемости, смертности, длительным пребыванием в стационаре4. Центры США по контролю и профилактике заболеваний сообщили, что около 7% всех протестированных образцов крови Candida устойчивы к противогрибковому препарату флуконазол5. Появление лекарственно-устойчивых видов Candida вызывает обеспокоенность по поводу разработки альтернативной или адъювантной терапии антимикотическими средствами.
Антимикробная фотодинамическая терапия (aPDT) включает активацию определенного фотосенсибилизатора (PS) светом на пиковой длине волны поглощения PS6. После возбуждения возбужденный PS передает свою энергию или электроны соседним молекулам кислорода и возвращается в основное состояние. Во время этого процесса образуются активные формы кислорода и синглетный кислород, которые вызывают повреждение клеток. aPDT широко используется для уничтожения микроорганизмов с 1990-х годов7. Одним из преимуществ aPDT является то, что множественные органеллы повреждаются в клетке синглетным кислородом и/или активными формами кислорода (АФК) во время облучения; таким образом, устойчивость к aPDT не была обнаружена до сегодняшнего дня. Более того, недавнее исследование показало, что бактерии, которые выжили после aPDT, стали более чувствительными к антибиотикам8.
Источники света, используемые в aPDT, включают лазеры, металлические галогенные лампы с фильтрами, ближний инфракрасный свет и светодиоды (LED)9,10,11,12. Лазер обеспечивает высокую световую мощность, обычно превышающую 0,5 Вт /см2, что позволяет доставлять высокую дозу света за очень короткое время. Он широко используется в тех случаях, когда более длительное время лечения неудобно, например, aPDT для инфекций полости рта. Недостатком лазера является то, что его размер пятна освещения небольшой, от нескольких сотен микрометров до 10 мм с рассеивателем. Кроме того, лазерное оборудование стоит дорого и нуждается в специальной подготовке для работы. С другой стороны, площадь облучения металлической галогенной лампы с фильтрами относительно больше13. Однако лампа слишком здоровенная и дорогая. Светодиодные источники света стали основным направлением aPDT в дерматологической области, потому что они небольшие и менее дорогие. Площадь облучения может быть относительно большой при массивном расположении светодиодной лампочки. Все лицо может быть освещено одновременно9. Тем не менее, большинство, если не все, светодиодные источники света, доступные сегодня, предназначены для клинического использования. Он может не подходить для экспериментов в лаборатории, потому что он занимает место и дорог. Мы разработали недорогой светодиодный массив, который очень мал и может быть вырезан и собран из светодиодной ленты. Светодиоды могут быть установлены в различных компоновках для различных экспериментальных конструкций. Различные условия aPDT могут быть выполнены в 96-луночной плите или даже 384-луночной пластине в одном эксперименте.
Роза бенгальская (RB) является цветным красителем, широко используемым для улучшения визуализации повреждений роговицы в глазах человека14. RB-опосредованный aPDT показал убийственное воздействие на золотистый стафилококк, Escherichia coli и C. albicans с примерно сопоставимой эффективностью с эффективностью Toluidine blue O15. Это исследование демонстрирует метод проверки влияния RB-aPDT на C. albicans с множественной лекарственной устойчивостью.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обнадеживающие результаты клинического применения RB-PDT при грибковом кератите были зарегистрированы недавно19. Пик поглощения RB находится на уровне 450-650 нм. Для успешного aPDT важно определить скорость флюенса источника света. Высокая флюенс (обычно >100 Дж /см2) требуетс?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа получила финансирование от Центра прикладной наномедицины, Национального университета Ченг Кунг от Программы Исследовательского центра избранных областей в рамках проекта «Ростки высшего образования» Министерства образования (MOE) и Министерства науки и технологий Тайваня [MOST 109-2327-B-006-005] до TW Wong. J.H. Hung признает финансирование от Национальной университетской больницы Чэн Кунг, Тайвань [NCKUH-11006018] и [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
- Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
- Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
- Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
- Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia – four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
- Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
- Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
- Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
- Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen’s disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
- Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
- Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
- Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
- Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
- Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
- Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
- Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
- Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
- Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).
