Candida albicans'ı İnhibe Etmek için Gül Bengal Aracılı Fotodinamik Terapi
Summary
İlaca dirençli Candida albicans’ın artan insidansı dünya çapında ciddi bir sağlık sorunudur. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), ilaca dirençli mantar enfeksiyonlarına karşı savaşmak için bir strateji sunabilir. Bu protokol, in vitro olarak çoklu ilaca dirençli C. albicans suşu üzerinde Gül bengal aracılı aPDT etkinliğini tanımlamaktadır.
Abstract
İnvaziv Candida albicans enfeksiyonu, insanlarda önemli bir fırsatçı mantar enfeksiyonudur, çünkü bağırsak, ağız, vajina ve cildin en yaygın kolonizatörlerinden biridir. Antifungal ilaçların mevcudiyetine rağmen, invaziv kandidiyazisin mortalite oranı ~% 50 oranında kalmaktadır. Ne yazık ki, ilaca dirençli C. albicans insidansı küresel olarak artmaktadır. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), C. albicans biyofilm oluşumunu inhibe etmek ve ilaç direncinin üstesinden gelmek için alternatif veya adjuvan bir tedavi sunabilir. Gül bengal (RB) aracılı aPDT, bakteri ve C. albicans’ın etkili hücre öldürmesini göstermiştir. Bu çalışmada, RB-aPDT’nin çoklu ilaca dirençli C. albicans üzerindeki etkinliği tanımlanmıştır. Ev yapımı yeşil ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı, 96 delikli bir plakanın kuyusunun ortasına hizalanacak şekilde tasarlanmıştır. Mayalar, farklı RB konsantrasyonlarına sahip kuyucuklarda inkübe edildi ve değişen yeşil ışık akıcılıkları ile aydınlatıldı. Öldürme etkileri plaka seyreltme yöntemi ile analiz edildi. Optimal bir ışık ve RB kombinasyonu ile 3 log büyüme inhibisyonu sağlandı. RB-aPDT’nin ilaca dirençli C. albicans’ı potansiyel olarak inhibe edebileceği sonucuna varılmıştır.
Introduction
C. albicans , sağlıklı bireylerin gastrointestinal ve genitoüriner yollarında kolonize olur ve bireylerin yaklaşık yüzde 50’sinde normal mikrobiyota olarak tespit edilebilir1. Konakçı ve patojen arasında bir dengesizlik yaratılırsa, C. albicans istila edebilir ve hastalığa neden olabilir. Enfeksiyon lokal mukoza zarı enfeksiyonlarından çoklu organ yetmezliğine kadar değişebilir2. ABD’de yapılan çok merkezli bir sürveyans çalışmasında, 2009 ve 2017 yılları arasında invaziv kandidiyazisli hastalardan alınan izolatların yaklaşık yarısı C. albicans3’tür. Kandidemi yüksek morbidite oranları, mortalite, hastanede kalış süresinin uzaması ile ilişkili olabilir4. ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri, test edilen tüm Candida kan örneklerinin yaklaşık% 7’sinin antifungal ilaç flukonazol5’e dirençli olduğunu bildirmiştir. İlaca dirençli Candida türlerinin ortaya çıkması, antimikotik ajanlara alternatif veya adjuvan bir tedavi geliştirme endişesini artırmaktadır.
Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), PS6’nın tepe absorpsiyon dalga boyunda ışıkla spesifik bir fotosensitizörün (PS) aktive edilmesini içerir. Uyarmadan sonra, uyarılmış PS enerjisini veya elektronlarını yakındaki oksijen moleküllerine aktarır ve zemin durumuna geri döner. Bu işlem sırasında reaktif oksijen türleri ve singlet oksijen oluşur ve hücre hasarına neden olur. aPDT, 1990’lardan beri mikroorganizmaları öldürmek için yaygın olarak kullanılmaktadır7. aPDT’nin faydalarından biri, ışınlama sırasında çoklu organellerin bir hücrede singlet oksijen ve / veya reaktif oksijen türleri (ROS) tarafından hasar görmesidir; bu nedenle aPDT’ye karşı direnç bugüne kadar bulunamamıştır. Ayrıca, yakın tarihli bir çalışma, aPDT’den sonra hayatta kalan bakterilerin antibiyotiklere karşı daha duyarlı hale geldiğini bildirmiştir8.
aPDT’de kullanılan ışık kaynakları arasında lazerler, filtreli metal halojen lambalar, yakın kızılötesi ışık ve ışık yayan diyot (LED)9,10,11,12 bulunur. Lazer, genellikle 0,5 W /cm2’den daha büyük olan ve çok kısa sürede yüksek ışık dozunun verilmesine izin veren yüksek ışık gücü sağlar. Oral enfeksiyonlar için aPDT gibi daha uzun bir tedavi süresinin sakıncalı olduğu durumlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bir lazerin dezavantajı, spot aydınlatma boyutunun birkaç yüz mikrometreden bir difüzörle 10 mm’ye kadar değişen küçük olmasıdır. Dahası, lazer ekipmanı pahalıdır ve çalışması için özel eğitime ihtiyaç duyar. Öte yandan, filtreli metal bir halojen lambanın ışınlama alanı nispeten daha büyüktür13. Ancak, lamba çok ağır ve pahalıdır. LED ışık kaynakları, dermatolojik alanda aPDT’nin ana akımı haline gelmiştir, çünkü küçük ve daha ucuzdur. Işınlama alanı, LED ampulün bir dizi düzenlemesi ile nispeten büyük olabilir. Tüm yüz aynı anda aydınlatılabilir9. Bununla birlikte, bugün mevcut olan LED ışık kaynaklarının hepsi olmasa da çoğu klinik kullanım için tasarlanmıştır. Bir laboratuvardaki deneyler için uygun olmayabilir, çünkü yer kaplayan ve pahalıdır. Çok küçük ve bir LED şeritten kesilip monte edilebilen ucuz bir LED dizisi geliştirdik. LED’ler farklı deneysel tasarımlar için farklı düzenlemelere takılabilir. Bir deneyde 96 delikli bir plakada veya hatta 384 delikli bir plakada farklı aPDT koşulları tamamlanabilir.
Gül bengal (RB), insan gözlerinde kornea hasarlarının görselleştirilmesini arttırmak için yaygın olarak kullanılan renkli bir boyadır14. RB aracılı aPDT, Staphylococcus aureus, Escherichia coli ve C. albicans üzerinde, Toluidin mavisi O15’inkiyle kabaca karşılaştırılabilir verimlilikte öldürücü etkiler göstermiştir. Bu çalışma, RB-aPDT’nin çoklu ilaca dirençli C. albicans üzerindeki etkisini doğrulamak için bir yöntem göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
RB-PDT’nin fungal keratit için klinik uygulamalarının cesaret verici sonuçları son zamanlarda bildirilmiştir19. RB’nin absorpsiyon zirvesi 450-650 nm’dir. Başarılı bir aPDT için ışık kaynağının akıcılık oranını belirlemek esastır. Kanser hücrelerini tedavi etmek için yüksek bir fluans (genellikle >100 J /cm2) gerekirken, enfekte lezyonları tedavi etmek için daha düşük bir fluans beklenmektedir6. Yüksek akıcılık, klinik bir ortamd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Eğitim Bakanlığı (MOE) ve Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı [MOST 109-2327-B-006-005] tarafından Yüksek Öğrenim Filiz Projesi çerçevesinde Öne Çıkan Alanlar Araştırma Merkezi Programı’ndan Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Uygulamalı Nanotıp Merkezi’nden TW Wong’a fon almıştır. J.H. Hung, Tayvan Ulusal Cheng Kung Üniversite Hastanesi’nden [NCKUH-11006018] ve [MOST 110-2314-B-006-086-MY3] gelen fonları kabul ediyor.
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
- Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
- Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
- Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
- Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia – four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
- Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
- Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
- Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
- Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen’s disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
- Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
- Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
- Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
- Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
- Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
- Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
- Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
- Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
- Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).
