Rose Bengal-medied fotodynamisk terapi för att hämma Candida albicans
Summary
Den ökande förekomsten av läkemedelsresistenta Candida albicans är ett allvarligt hälsoproblem över hela världen. Antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT) kan erbjuda en strategi för att bekämpa läkemedelsresistenta svampinfektioner. Det föreliggande protokollet beskriver Rose bengal-medierad aPDT-effekt på en multiresistent C. albicans-stam in vitro.
Abstract
Invasiv Candida albicans-infektion är en signifikant opportunistisk svampinfektion hos människor eftersom det är en av de vanligaste kolonisatörerna i tarmen, munnen, slidan och huden. Trots tillgången på svampdödande läkemedel förblir dödligheten för invasiv candidiasis ~ 50%. Tyvärr ökar förekomsten av läkemedelsresistenta C. albicans globalt. Antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT) kan erbjuda en alternativ eller adjuvant behandling för att hämma C. albicans biofilmbildning och övervinna läkemedelsresistens. Rose bengal (RB) -medierad aPDT har visat effektiv celldödande av bakterier och C. albicans. I denna studie beskrivs effekten av RB-aPDT på multiresistenta C. albicans . En hemlagad grön ljusdiod (LED) ljuskälla är utformad för att anpassa sig till mitten av en brunn på en 96-brunnsplatta. Jästen inkuberades i brunnarna med olika koncentrationer av RB och upplystes med varierande flytande grönt ljus. De dödande effekterna analyserades med plattutspädningsmetoden. Med en optimal kombination av ljus och RB uppnåddes 3-log tillväxthämning. Det drogs slutsatsen att RB-aPDT potentiellt kan hämma läkemedelsresistenta C. albicans.
Introduction
C. albicans koloniserar i mag-tarmkanalen och könsorganen hos friska individer och kan detekteras som normal mikrobiota hos cirka 50 procent av individerna1. Om en obalans skapas mellan värden och patogenen kan C. albicans invadera och orsaka sjukdom. Infektionen kan sträcka sig från lokala slemhinnor till multipel organsvikt2. I en övervakningsstudie med flera center i USA är ungefär hälften av isolaten från patienter med invasiv candidiasis mellan 2009 och 2017 C. albicans3. Candidemi kan associeras med hög sjuklighet, dödlighet, långvarig sjukhusvistelse4. US Centers of Disease Control and Prevention rapporterade att cirka 7% av alla Candida blodprover som testats är resistenta mot det svampdödande läkemedlet flukonazol5. Framväxten av läkemedelsresistenta Candida-arter väcker oro för att utveckla en alternativ eller adjuvansbehandling till antimykotiska medel.
Antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT) innebär att man aktiverar en specifik fotosensibiliserare (PS) med ljus vid PS6: s högsta absorptionsvåglängd. Efter excitation överför den exciterade PS sin energi eller elektroner till de närliggande syremolekylerna och återgår till marktillståndet. Under denna process bildas reaktiva syrearter och singlet syre och orsakar cellskador. aPDT har använts i stor utsträckning för att döda mikroorganismer sedan 1990-talet7. En av fördelarna med aPDT är att flera organeller skadas i en cell av singlet syre och / eller reaktiva syrearter (ROS) under bestrålning; således har motstånd mot aPDT inte hittats förrän idag. Dessutom rapporterade en ny studie att bakterierna som överlevde efter aPDT blev känsligare för antibiotika8.
Ljuskällorna som används i aPDT inkluderar lasrar, metallhalogenlampor med filter, nära infrarött ljus och ljusdiod (LED) 9,10,11,12. Lasern ger en hög ljuseffekt, vanligtvis större än 0,5 W / cm2, som möjliggör leverans av en hög ljusdos på mycket kort tid. Det har använts i stor utsträckning i fall där en längre behandlingstid är obekvämt, såsom aPDT för orala infektioner. Nackdelen med en laser är att dess fläckstorlek på belysningen är liten, allt från några hundra mikrometer till 10 mm med en diffusor. Dessutom är laserutrustning dyr och behöver särskild utbildning för att fungera. Å andra sidan är bestrålningsområdet för en metallhalogenlampa med filter relativt större13. Lampan är dock för rejäl och dyr. LED-ljuskällor har blivit vanliga av aPDT inom det dermatologiska området eftersom det är litet och billigare. Bestrålningsområdet kan vara relativt stort med ett matrisarrangemang av LED-glödlampan. Hela ansiktet kan belysas samtidigt9. Ändå, de flesta, om inte alla, LED-ljuskällor som finns tillgängliga idag är utformade för klinisk användning. Det kanske inte är lämpligt för experiment i ett laboratorium eftersom det är rymdupptåt och dyrt. Vi utvecklade en billig LED-matris som är mycket liten och kan klippas och monteras från en LED-remsa. Lysdioderna kan monteras i olika arrangemang för olika experimentella konstruktioner. Olika förhållanden för aPDT kan slutföras i en 96-brunnsplatta eller till och med en 384-brunnsplatta i ett experiment.
Rose bengal (RB) är ett färgat färgämne som ofta används för att förbättra visualiseringen av hornhinneskador i mänskliga ögon14. RB-medierad aPDT har visat dödande effekter på Staphylococcus aureus, Escherichia coli och C. albicans med ungefär jämförbar effektivitet med toluidinblåO15. Denna studie visar en metod för att validera effekten av RB-aPDT på multiresistenta C. albicans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uppmuntrande resultat av kliniska tillämpningar av RB-PDT för svampkeratit har nyligen rapporterats19. Absorptionstoppen för RB är vid 450-650 nm. Det är viktigt att bestämma ljuskällans flythastighet för en framgångsrik aPDT. En hög fluens (vanligtvis >100 J / cm2) krävs för att behandla cancerceller, medan en lägre fluens förväntas behandla infekterade lesioner6. En hög fluens innebär en lång exponeringstid som kanske inte är praktisk i en kl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har fått finansiering från Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University från Featured Areas Research Center Program inom ramen för Higher Education Sprout Project av utbildningsministeriet (MOE) och ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] till TW Wong. J.H. Hung erkänner finansiering från National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018] och [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
- Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
- Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
- Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
- Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia – four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
- Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
- Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
- Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
- Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen’s disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
- Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
- Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
- Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
- Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
- Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
- Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
- Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
- Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
- Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).
