Denne protokol beskriver en brugervenlig metode til at undersøge substratoxidation ved at spore 14CO2 –produktion in vitro.
Mitokondrier er vært for maskineriet til tricarboxylsyre (TCA) cyklus og elektrontransportkæde (ETC), som genererer adenosintrifosfat (ATP) for at opretholde energihomeostase. Glukose, fedtsyrer og aminosyrer er de vigtigste energisubstrater, der brænder mitokondriel respiration i de fleste somatiske celler. Beviser viser, at forskellige celletyper kan have en særskilt præference for visse substrater. Imidlertid er substratudnyttelse af forskellige celler i skelettet ikke blevet undersøgt i detaljer. Da cellulær metabolisme er tilpasset fysiologiske og patofysiologiske ændringer, kan direkte vurderinger af substratafhængighed i skeletceller desuden give vigtig indsigt i patogenesen af knoglesygdomme.
Følgende protokol er baseret på princippet om frigivelse af kuldioxid fra substratmolekyler efter oxidativ phosphorylering. Ved at anvende substrater, der indeholder radioaktivt mærkede carbonatomer (14C), tilvejebringer metoden et følsomt og brugervenligt assay for hastigheden af substratoxidation i cellekultur. Et casestudie med primære kalvariale preosteoblaster versus knoglemarvsafledte makrofager (BMM’er) viser forskellig udnyttelse af hovedsubstraterne mellem de to celletyper.
Oxidativ fosforylering (OXPHOS) i eukaryoter er den proces, hvorved næringsstoffer nedbrydes inde i mitokondrier for at frigive kemisk energi i form af ATP gennem forbrug af ilt. Katabolisme af forskellige substrater inde i mitokondrier gennem tricarboxylsyre (TCA) cyklus genererer få ATP molekyler direkte, men lagrer snarere energi gennem reduktion af elektronbærerne nicotinamid adenin dinukleotid (NAD +) og flavinadenin dinukleotid (FAD +). De reducerede bærere oxideres derefter af ETC placeret på mitokondriernes indre membran for at generere en protonkoncentrationsgradient over membranen. Protonerne strømmer til sidst ned ad deres gradient tilbage i mitokondrielle matrix gennem ATP-syntase for at producere ATP. OXPHOS er det mest effektive middel til ATP-produktion fra energisubstrater og foretrækkes generelt i aerobe miljøer. Tidligere blev aerob glykolyse – produktion af laktat fra glukose, mens ilt er til stede – anset for at være patofysiologisk, ofte et kendetegn for kræftceller. Mere og mere opdages det, at nogle normale celletyper bruger aerob glykolyse af grunde, der endnu ikke er fuldt dechiffreret.
Metabolisk fleksibilitet er cellers eller organismers evne til at tilpasse sig skiftende energibehov og tilgængelige brændstofkilder. For eksempel imødekommes den energiske efterspørgsel efter skeletmuskulatur hovedsageligt af OXPHOS ved steady state, men af anaerob glykolyse under træning med høj intensitet1. Efterhånden som træningsvarigheden øges, bidrager glukose og fedtsyreoxidation mere til den samlede energiproduktion2. Imidlertid er substratbrug ikke kun afhængig af tilgængelighed, da substrater antagonistisk konkurrerer under oxidation. Mest bemærkelsesværdigt har fedtsyreoxidation vist sig at hæmme glukoseudnyttelsen af skeletmuskulaturen i et fænomen kendt som Randle-effekten3. En gensidig effekt blev påvist ved efterfølgende undersøgelser 4,5. Derudover er mange sygdomme forbundet med en ændring i substratpræference og udviklingen af metabolisk ufleksibilitet i celler. For eksempel reduceres fedtsyreoxidation i skeletmuskulaturen hos type II-diabetespatienter sammenlignet med normale kontrolpersoner6. De metaboliske ændringer i sygdomsindstillinger er genstand for intens undersøgelse, da de kan bidrage til patogenese.
Energimetabolisme i skeletcelletyper er relativt underundersøgt, men har fået opmærksomhed i de senere år7. Tidligere arbejde har vist, at aerob glykolyse er den dominerende energivej i kalvariale osteoblaster, mens glukoseoxidation gennem TCA-cyklussen spiller en rolle i osteoklastdannelse 8,9. Andre har fremlagt beviser for fedtsyrer som energikilde til osteoblaster10. Glutaminkatabolisme har også vist sig at understøtte osteoblastdifferentiering fra forfædrene11,12. Imidlertid mangler der stadig en omfattende forståelse af substratudnyttelse af forskellige skeletcelletyper. Derudover forventes ændringer i cellulær metabolisme under celledifferentiering eller som reaktion på patologiske signaler at ændre udnyttelsen af brændstofsubstratet. Beskrevet nedenfor er en brugervenlig protokol til analyse af substratoxidation in vitro.
Protokollen giver en brugervenlig metode til at bestemme oxidationshastigheden for større energisubstrater. Det er et enklere alternativ til andre protokoller, der bruger kolber, der indeholder en central brønd og er dækket af gummipropper 14,15,16. Selvom eksempelstudiet her udføres med cellekultur, kan metoden let tilpasses vævseksplanter eller vævshomogenater indeholdende intakte mitokondrier, som tidligere beskrevet<su…
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev delvist støttet af NIH-bevilling R01 AR060456 (FL). Vi takker Dr. Michael Robinson og Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) for deres generøse hjælp med scintillationstælleren.
0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |