הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם לכידת CO 2 14
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לשימוש לבחינת חמצון מצע על ידי מעקב אחר ייצור 14CO2 במבחנה.
Abstract
המיטוכונדריה מארחת את המכונות למחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) ולשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC), המייצרות אדנוזין טריפוספט (ATP) כדי לשמור על הומאוסטזיס של אנרגיה. גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו הם מצעי האנרגיה העיקריים המניעים את הנשימה המיטוכונדרית ברוב התאים הסומאטיים. עדויות מראות שלסוגי תאים שונים עשויה להיות העדפה מובהקת למצעים מסוימים. עם זאת, ניצול המצע על ידי תאים שונים בשלד לא נחקר בפירוט. יתר על כן, מכיוון שמטבוליזם תאי מכוון לשינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, הערכות ישירות של תלות במצע בתאי השלד עשויות לספק תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות עצם.
הפרוטוקול הבא מבוסס על העיקרון של שחרור פחמן דו חמצני ממולקולות מצע לאחר זרחון חמצוני. על ידי שימוש במצעים המכילים אטומי פחמן המסומנים באופן רדיואקטיבי (14C), השיטה מספקת בדיקה רגישה וקלה לשימוש לקצב חמצון המצע בתרבית תאים. מקרה בוחן עם פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMMs) מדגים ניצול שונה של המצעים העיקריים בין שני סוגי התאים.
Introduction
זרחון חמצוני (OXPHOS) באאוקריוטים הוא התהליך שבו חומרי מזון מתפרקים בתוך המיטוכונדריה כדי לשחרר אנרגיה כימית בצורה של ATP באמצעות צריכת חמצן. קטבוליזם של מצעים שונים בתוך המיטוכונדריה באמצעות מחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) מייצר מעט מולקולות ATP ישירות, אלא מאחסן אנרגיה באמצעות הפחתה של נושאי האלקטרונים ניקוטיןמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD+) ופלווין אדנין דינוקלאוטיד (FAD+). לאחר מכן הנשאים המופחתים מתחמצנים על ידי ETC הממוקם על הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה כדי ליצור שיפוע ריכוז פרוטונים על פני הממברנה. הפרוטונים זורמים בסופו של דבר במורד השיפוע שלהם בחזרה לתוך המטריצה המיטוכונדריאלית דרך ATP synthase כדי לייצר ATP. OXPHOS הוא האמצעי היעיל ביותר לייצור ATP מצעי אנרגיה ומועדף בדרך כלל בסביבות אירוביות. בעבר, גליקוליזה אירובית – ייצור של לקטט מגלוקוז בזמן שיש חמצן – נחשבה לפתופיזיולוגית, לעתים קרובות סימן היכר של תאים סרטניים. יותר ויותר, מתגלה כי כמה סוגי תאים נורמליים משתמשים בגליקוליזה אירובית מסיבות שעדיין לא פוענחו במלואן.
גמישות מטבולית היא היכולת של תאים או אורגניזמים להסתגל לדרישות האנרגיה המשתנות ולמקורות הדלק הזמינים. לדוגמה, הביקוש האנרגטי של שרירי השלד נענה בעיקר על ידי OXPHOS במצב יציב אך על ידי גליקוליזה אנאירובית במהלך תרגיל בעצימות גבוהה1. ככל שמשך הפעילות הגופנית גדל, חמצון הגלוקוז וחומצות השומן תורמים יותר לייצור האנרגיה הכולל2. עם זאת, השימוש במצע אינו תלוי רק בזמינות, שכן מצעים מתחרים באופן אנטגוניסטי במהלך חמצון. בעיקר, חמצון חומצות שומן הוכח כמעכב את ניצול הגלוקוז על ידי שרירי השלד בתופעה הידועה בשם אפקט רנדל3. השפעה הדדית הודגמה על ידי מחקרים מאוחרים יותר 4,5. בנוסף, מחלות רבות קשורות לשינוי בהעדפת המצע ולהתפתחות של חוסר גמישות מטבולית בתאים. לדוגמה, חמצון חומצות שומן מופחת בשריר השלד של חולי סוכרת מסוג II בהשוואה לנבדקי ביקורת רגילים6. השינויים המטבוליים בהגדרות המחלה הם נושא לחקירה אינטנסיבית מכיוון שהם עשויים לתרום לפתוגנזה.
חילוף החומרים האנרגטי בסוגי תאי השלד הוא יחסית לא מובן מאליו, אך זכה לתשומת לב בשנים האחרונות7. עבודות קודמות הראו כי גליקוליזה אירובית היא מסלול האנרגיה הדומיננטי באוסטאובלסטים קלבריאליים, בעוד שחמצון גלוקוז באמצעות מחזור TCA ממלא תפקיד בהיווצרות אוסטאוקלסט 8,9. אחרים סיפקו ראיות לחומצות שומן כמקור אנרגיה לאוסטאובלסטים10. כמו כן, הוכח כי קטבוליזם של גלוטמין תומך בהתמיינות אוסטאובלסט מאבותאבותיהם 11,12. עם זאת, עדיין חסרה הבנה מקיפה של שימוש במצע על ידי סוגי תאי שלד שונים. בנוסף, שינויים בחילוף החומרים התאי במהלך התמיינות תאים או בתגובה לאותות פתולוגיים צפויים לשנות את ניצול מצע הדלק. להלן פרוטוקול קל לשימוש לבדיקת חמצון מצע במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול מספק שיטה קלה לשימוש לקביעת קצב החמצון של מצעי אנרגיה עיקריים. זוהי חלופה פשוטה יותר לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בצלוחיות המכילות באר מרכזית ומכוסות בפקקי גומי 14,15,16. למרות שהמחקר לדוגמה כאן מבוצע עם תרבית תאים, ניתן להתאים את ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה בחלקה על ידי מענק NIH R01 AR060456 (FL). אנו מודים לד”ר מייקל רובינסון ואליזבת קריזמן (בית החולים לילדים של פילדלפיה) על עזרתם הנדיבה במונה ההברקה.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
