Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec piégeage de 14CO2

Résumé

Ce protocole décrit une méthode facile à utiliser pour examiner l’oxydation du substrat en suivant la production de ¹⁴CO₂ in vitro.

Résumé

Les mitochondries hébergent la machinerie du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et de la chaîne de transport d’électrons (ETC), qui génèrent de l’adénosine triphosphate (ATP) pour maintenir l’homéostasie énergétique. Le glucose, les acides gras et les acides aminés sont les principaux substrats énergétiques alimentant la respiration mitochondriale dans la plupart des cellules somatiques. Les preuves montrent que différents types de cellules peuvent avoir une préférence distincte pour certains substrats. Cependant, l’utilisation du substrat par diverses cellules du squelette n’a pas été étudiée en détail. De plus, comme le métabolisme cellulaire est adapté aux changements physiologiques et physiopathologiques, des évaluations directes de la dépendance au substrat dans les cellules squelettiques peuvent fournir des informations importantes sur la pathogenèse des maladies osseuses.

Le protocole suivant est basé sur le principe de la libération de dioxyde de carbone par les molécules de substrat après phosphorylation oxydative. En utilisant des substrats contenant des atomes de carbone marqués radioactivement (¹⁴C), la méthode fournit un test sensible et facile à utiliser pour le taux d’oxydation du substrat en culture cellulaire. Une étude de cas avec des préostéoblastes calvariaires primaires par rapport à des macrophages dérivés de la moelle osseuse (MGM) démontre une utilisation différente des principaux substrats entre les deux types de cellules.

Introduction

La phosphorylation oxydative (OXPHOS) chez les eucaryotes est le processus par lequel les nutriments sont décomposés à l’intérieur des mitochondries pour libérer de l’énergie chimique sous forme d’ATP par la consommation d’oxygène.  Le catabolisme de divers substrats à l’intérieur des mitochondries par le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) génère directement peu de molécules d’ATP, mais stocke plutôt de l’énergie par réduction des transporteurs d’électrons nicotinamide adénine dinucléotide (NAD⁺) et flavine adénine dinucléotide (FAD⁺). Les porteurs réduits sont ensuite oxydés par ETC situé sur la membrane interne des mitochondries pour génére....

Protocole

L’utilisation de matières radioactives (RAM) nécessite l’approbation préalable d’un comité de sûreté désigné dans chaque établissement. Les RAM utilisés dans ce protocole ont été approuvés par Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) de l’Université de Pennsylvanie. L’utilisation d’animaux nécessite l’approbation préalable du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement d’origine. L’étude suivante a été approuvée par l’IACUC à l’hôpital pour enfants de Philadelphie.

1. Préparation de solutions mères pour ¹⁴substrats marqués C

1. Préparer une solution mère d’a....

Résultats

Dans cet exemple, la méthode de piégeage du CO₂ est utilisée pour comparer l’oxydation du substrat par les préostéoblastes calvariaires primaires par rapport aux MBM, qui sont fréquemment utilisés pour la différenciation in vitro des ostéoblastes ou des ostéoclastes, respectivement. Une fois que les cellules primaires sont passées et cultivées dans cMEMα pendant la nuit, elles atteignent généralement 80 à 90% de la confluence et présentent leur morphologie caractéristique. Les préostéoblastes calvaria.......

Discussion

Le protocole fournit une méthode facile à utiliser pour déterminer le taux d’oxydation des principaux substrats énergétiques. C’est une alternative plus simple aux autres protocoles qui utilisent des flacons contenant un puits central et coiffés de bouchons en caoutchouc 14,15,16. Bien que l’exemple d’étude ici soit réalisé avec une culture cellulaire, la méthode peut être facilement adaptée pour les explantes tissulaires ou les.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 et micro ; m filtres	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Utilisé pour filtrer la solution BSA
0,25 % Trypsine-EDTA	Gibco	25200056	Dissocier les cellules des plaques de culture cellulaire
1,5 mL Tubes Eppendorf	PR1MA	PR MCT17 RB	Utilisé pour l’incubation réactionnelle
Plaques de 10 cm	TPP	93100	Utilisé pour la culture cellulaire
Seringue 10 mL	BD	302995	Utilisé pour rincer la moelle osseuse des os longs
10 % FBS	Atlanta biologicals	S11550	Pour la préparation de milieux de culture cellulaire
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Utilisé pour fabriquer des milieux
chauds14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Utilisé pour fabriquer des milieux
chauds14C-oléate	PerkinElmer	NEC317050UC	Utilisé pour fabriquer des supports chauds
Aiguille 23 G	BD	305120	Utilisé pour rincer la moelle des os longs Plaques
24 puits	TPP	92024	Utilisé pour la culture cellulaire
70 &mu ; Passoires à cellules m	MIDSCI	70CELL	Utilisé pour filtrer le surnageant pendant la digestion cavariale
Colorant Acridine Orange/Iodure de propidium (AO/PI)	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Colore les cellules vivantes pour déterminer la densité des graines
Sérum bovin Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Utilisé pour la conjugaison des acides gras
Cellomètre Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Déterminer le nombre de cellules viables
Centrifugeuse	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Utilisé pour granuler les cellules
Collagénase de type II	Worthington	LS004176	Dissocier les cellules du tissu
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU : ME 18459P1	Utilisé pour créer des milieux chauds personnalisés
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Utilisé pour dissoudre et diluer les réactifs, et laver les plats de culture
Papier filtre	Millipore-Sigma	WHA1001090	Pièges à CO2 avec hydroxyde de sodium
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Utilisé pour fabriquer des supports personnalisés
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 pendant la culture cellulaire
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplémenté pour l’oxydation des acides gras
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Utilisé pour fabriquer des milieux personnalisés
MEM alpha	Thermo	A10490	Milieu de culture cellulaire
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Utilisé pour sceller les boîtes de culture cellulaire
Pénicilline-Streptomycine	Thermo Fisher	15140122	Empêche la contamination dans la culture cellulaire
Acide perchlorique	Sigma-Aldrich	244252	Libère du CO2 lors d’un dosage métabolique
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Utilisé pour fabriquer des supports personnalisés
Compteur de scintillation	Beckman Coulter	LS6500	Détermine la radioactivité du papier filtre
Fluide à scintillation	MP Biomedicals	882453	Absorber l’énergie émise par les RAM et la réémettre sous forme d’éclairs de lumière
Fiole à scintillation	Fisher Scientific	03-337-1	Récipients de réaction pour fluide à scintillation
Carbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S5761	Tampon d’équilibre pour hydroxyde de
sodium	Sigma-Aldrich	58045	Piège le CO2 pendant le dosage de l’oléate
	de sodiumSANTA CRUZ	SC-215879	BSA préparation d’acides gras conjugués
Filtration sous vide 1000	TPP	99950	Filtre cMEM&alpha ;

à moyen