14सीओ2 फँसाने के साथ विट्रो में ऊर्जा सब्सट्रेट ऑक्सीकरण का आकलन
Summary
यह प्रोटोकॉल विट्रो में 14सीओ2 उत्पादन को ट्रैक करके सब्सट्रेट ऑक्सीकरण की जांच करने के लिए एक आसान-से-उपयोग विधि का वर्णन करता है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रिया ट्राइकार्बोक्जिलिक एसिड (टीसीए) चक्र और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) के लिए मशीनरी की मेजबानी करता है, जो ऊर्जा होमोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पन्न करता है। ग्लूकोज, फैटी एसिड, और अमीनो एसिड अधिकांश दैहिक कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को बढ़ावा देने वाले प्रमुख ऊर्जा सब्सट्रेट हैं। साक्ष्य से पता चलता है कि विभिन्न सेल प्रकारों में कुछ सब्सट्रेट्स के लिए एक अलग प्राथमिकता हो सकती है। हालांकि, कंकाल में विभिन्न कोशिकाओं द्वारा सब्सट्रेट उपयोग का विस्तार से अध्ययन नहीं किया गया है। इसके अलावा, जैसा कि सेलुलर चयापचय शारीरिक और pathophysiological परिवर्तनों के लिए attuned है, कंकाल कोशिकाओं में सब्सट्रेट निर्भरता के प्रत्यक्ष आकलन हड्डी रोगों के रोगजनन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के बाद सब्सट्रेट अणुओं से कार्बन डाइऑक्साइड रिलीज के सिद्धांत पर आधारित है। रेडियोधर्मी रूप से लेबल कार्बन परमाणुओं (14सी) युक्त substrates का उपयोग करके, विधि सेल संस्कृति में सब्सट्रेट ऑक्सीकरण की दर के लिए एक संवेदनशील और आसान उपयोग परख प्रदान करता है। प्राथमिक calvarial preosteoblasts बनाम अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMMs) के साथ एक मामले का अध्ययन दो सेल प्रकारों के बीच मुख्य substrates के विभिन्न उपयोग को दर्शाता है।
Introduction
यूकेरियोट्स में ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (OXPHOS) वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा ऑक्सीजन की खपत के माध्यम से एटीपी के रूप में रासायनिक ऊर्जा को छोड़ने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के अंदर पोषक तत्वों को तोड़ दिया जाता है। ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड (टीसीए) चक्र के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया के अंदर विभिन्न सब्सट्रेट्स का अपचय सीधे कुछ एटीपी अणुओं को उत्पन्न करता है, बल्कि इलेक्ट्रॉन वाहक निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडी +) और फ्लेविन एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एफएडी +) की कमी के माध्यम से ऊर्जा संग्रहीत करता है। कम वाहक को तब माइटोकॉन्ड्रिया के आंतरिक झिल्ली पर स्थित ईटीसी द्वारा ऑक्सीकरण किया जाता है ताकि झिल्ली के पार एक प्रोटॉन एकाग्रता ढाल उत्पन्न किया जा सके। प्रोटॉन अंततः एटीपी सिंथेज़ के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में अपने ग्रेडिएंट को वापस प्रवाहित करते हैं ताकि एटीपी का उत्पादन किया जा सके। OXPHOS ऊर्जा substrates से एटीपी उत्पादन का सबसे कुशल साधन है और आम तौर पर एरोबिक वातावरण में पसंद किया जाता है। इससे पहले, एरोबिक ग्लाइकोलाइसिस-ग्लूकोज से लैक्टेट का उत्पादन, जबकि ऑक्सीजन मौजूद है- पैथोफिजियोलॉजिकल माना जाता था, अक्सर कैंसर कोशिकाओं की एक पहचान होती है। अधिक से अधिक, यह पता लगाया जा रहा है कि कुछ सामान्य सेल प्रकार उन कारणों के लिए एरोबिक ग्लाइकोलाइसिस का उपयोग करते हैं जिन्हें अभी तक पूरी तरह से समझा जाना बाकी है।
चयापचय लचीलापन कोशिकाओं या जीवों के लिए बदलती ऊर्जा मांगों और उपलब्ध ईंधन स्रोतों के अनुकूल होने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, कंकाल की मांसपेशियों की ऊर्जावान मांग मुख्य रूप से स्थिर अवस्था में OXPHOS द्वारा पूरी की जाती है, लेकिन उच्च तीव्रता वाले व्यायाम के दौरान एनारोबिक ग्लाइकोलाइसिसद्वारा 1। जैसे-जैसे व्यायाम की अवधि बढ़ती है, ग्लूकोज और फैटी एसिड ऑक्सीकरण समग्र ऊर्जा उत्पादन में अधिक योगदानदेते हैं। हालांकि, सब्सट्रेट का उपयोग केवल उपलब्धता पर निर्भर नहीं है, क्योंकि सब्सट्रेट ऑक्सीकरण के दौरान विरोधी रूप से प्रतिस्पर्धा करते हैं। सबसे विशेष रूप से, फैटी एसिड ऑक्सीकरण को रैंडल प्रभाव 3 के रूप में जानी जाने वाली घटना में कंकाल की मांसपेशी द्वारा ग्लूकोज के उपयोग को बाधित करने के लिए दिखाया गयाहै। एक पारस्परिक प्रभाव बाद केअध्ययनों 4,5 द्वारा प्रदर्शित किया गया था। इसके अलावा, कई बीमारियां सब्सट्रेट वरीयता में बदलाव और कोशिकाओं में चयापचय लचीलेपन के विकास से जुड़ी हुई हैं। उदाहरण के लिए, फैटी एसिड ऑक्सीकरण सामान्य नियंत्रण विषयों की तुलना में टाइप II मधुमेह रोगियों की कंकाल की मांसपेशियों में कम हो जाताहै। रोग सेटिंग्स में चयापचय परिवर्तन गहन जांच का विषय हैं क्योंकि वे रोगजनन में योगदान कर सकते हैं।
कंकाल सेल प्रकारों में ऊर्जा चयापचय अपेक्षाकृत कम अध्ययन किया जाता है, लेकिन हाल के वर्षों में ध्यान आकर्षित किया गयाहै 7। पिछले काम से पता चला है कि एरोबिक ग्लाइकोलाइसिस कैल्वैरियल ओस्टियोब्लास्ट में प्रमुख ऊर्जा मार्ग है, जबकि टीसीए चक्र के माध्यम से ग्लूकोज ऑक्सीकरण ओस्टियोक्लास्ट गठन 8,9 में एक भूमिका निभाता है। दूसरों ने ओस्टियोब्लास्ट्स10 के लिए ऊर्जा स्रोत के रूप में फैटी एसिड के लिए सबूत प्रदान किए हैं। ग्लूटामाइन कैटाबोलिज्म कोपूर्वजों 11,12 से ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव का समर्थन करने के लिए भी दिखाया गया है। हालांकि, विभिन्न कंकाल सेल प्रकारों द्वारा सब्सट्रेट उपयोग की एक व्यापक समझ अभी भी कमी है। इसके अलावा, सेल भेदभाव के दौरान या पैथोलॉजिकल संकेतों के जवाब में सेलुलर चयापचय में परिवर्तन से ईंधन सब्सट्रेट उपयोग को बदलने की उम्मीद है। नीचे वर्णित विट्रो में सब्सट्रेट ऑक्सीकरण assaying के लिए एक आसान करने के लिए उपयोग प्रोटोकॉल है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल प्रमुख ऊर्जा सब्सट्रेट की ऑक्सीकरण दर निर्धारित करने के लिए एक आसान-से-उपयोग विधि प्रदान करता है। यह अन्य प्रोटोकॉल के लिए एक सरल विकल्प है जो फ्लास्क का उपयोग करता है जिसमें एक केंद्रीय अच्…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम एनआईएच अनुदान R01 AR060456 (FL) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। हम डॉ माइकल रॉबिन्सन और एलिजाबेथ क्रिज़मैन (फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल) को सिंटिलेशन काउंटर के साथ उनकी उदार मदद के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
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