14CO2트래핑을 사용한 시험관내 에너지 기질 산화 평가
Summary
이 프로토콜은 시험관내에서 14CO2생산을 추적함으로써 기질 산화를 검사하는 사용하기 쉬운 방법을 기술한다.
Abstract
미토콘드리아는 에너지 항상성을 유지하기 위해 아데노신 삼인산염(ATP)을 생성하는 트리카르복실산(TCA) 사이클 및 전자 수송 사슬(ETC)을 위한 기계장치를 호스트한다. 포도당, 지방산 및 아미노산은 대부분의 체세포에서 미토콘드리아 호흡을 촉진하는 주요 에너지 기질입니다. 증거는 상이한 세포 유형이 특정 기질에 대해 뚜렷한 선호도를 가질 수 있음을 보여준다. 그러나, 골격 내의 다양한 세포에 의한 기질 활용은 구체적으로 연구되지 않았다. 더욱이, 세포 대사가 생리학적 및 병리생리학적 변화에 적응함에 따라, 골격 세포에서의 기질 의존성에 대한 직접적인 평가는 뼈 질환의 발병기전에 대한 중요한 통찰을 제공할 수 있다.
다음 프로토콜은 산화 인산화 후 기질 분자로부터 이산화탄소가 방출되는 원리에 기초한다. 방사성으로 표지된 탄소 원자(14C)를 함유하는 기질을 사용함으로써, 이 방법은 세포 배양물에서 기질 산화의 속도에 대한 민감하고 사용하기 쉬운 검정을 제공한다. 일차 calvarial preosteoblasts 대 골수 유래 대식세포 (BMMs)를 사용한 사례 연구는 두 세포 유형 사이의 주요 기질의 다른 활용을 보여줍니다.
Introduction
진핵생물의 산화적 인산화(OXPHOS)는 미토콘드리아 내부에서 영양분이 분해되어 산소 소비를 통해 ATP 형태로 화학 에너지를 방출하는 과정입니다. 트리카르복실산(TCA) 사이클을 통해 미토콘드리아 내부의 다양한 기질의 이화작용은 직접 ATP 분자를 거의 생성하지 않지만, 오히려 전자 운반체인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD+)의 환원을 통해 에너지를 저장한다. 환원된 담체는 이어서 미토콘드리아의 내막에 위치한 ETC에 의해 산화되어 막을 가로질러 양성자 농도 구배를 생성한다. 양성자는 결국 ATP 신타제를 통해 미토콘드리아 매트릭스로 다시 구배를 흘러 ATP를 생성합니다. OXPHOS는 에너지 기질로부터 ATP를 생산하는 가장 효율적인 수단이며 일반적으로 호기성 환경에서 선호됩니다. 이전에, 호기성 글리코분해-산소가 존재하는 동안 글루코스로부터의 락테이트의 생산-병리생리학적, 종종 암 세포의 특징인 것으로 생각되었다. 점점 더 많은 수의 정상적인 세포 유형이 아직 완전히 해독되지 않은 이유로 호기성 글리코 분해를 사용한다는 것이 발견되고 있습니다.
대사 유연성은 세포 또는 유기체가 변화하는 에너지 요구와 사용 가능한 연료 원에 적응할 수있는 능력입니다. 예를 들어, 골격근의 에너지 수요는 주로 정상 상태에서 OXPHOS에 의해 충족되지만 고강도 운동 중 혐기성 당분해에 의해 충족됩니다1. 운동 기간이 증가함에 따라 포도당과 지방산 산화는 전반적인 에너지 생산에 더 많은 기여를합니다 2. 그러나, 기질 사용은 기질이 산화 동안 적대적으로 경쟁하기 때문에 가용성에만 의존하지 않는다. 가장 주목할 만하게, 지방산 산화는 랜들 효과3로 알려진 현상으로 골격근에 의한 글루코스 이용을 억제하는 것으로 나타났다. 상호 효과는 후속 연구 4,5에 의해 입증되었다. 또한, 많은 질병들은 기질 선호도의 변화 및 세포에서의 대사 유연성의 발달과 관련된다. 예를 들어, 지방산 산화는 정상 대조군 피험자6에 비해 II형 당뇨병 환자의 골격근에서 감소된다. 질병 설정의 대사 변화는 병인에 기여할 수 있기 때문에 집중적 인 조사의 대상입니다.
골격 세포 유형의 에너지 대사는 상대적으로 과소 연구되었지만 최근 몇 년 동안 주목을 받고 있습니다7. 이전의 연구는 호기성 당분해가 calvarial 조골 세포에서 지배적 인 에너지 경로이며, TCA 사이클을 통한 포도당 산화가 파골세포 형성 8,9에서 중요한 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 다른 사람들은 조골 세포10의 에너지 원으로서 지방산에 대한 증거를 제공했습니다. 글루타민 이화작용은 또한 선조(11,12)로부터의 조골세포 분화를 지지하는 것으로 나타났다. 그러나, 다양한 골격 세포 유형에 의한 기질 이용에 대한 포괄적인 이해는 여전히 부족하다. 또한, 세포 분화 동안 또는 병리학적 신호에 반응하여 세포 대사의 변화는 연료 기질 이용을 변화시킬 것으로 예상된다. 이하에 기재된 것은 시험관내에서 기질 산화를 검정하기 위한 사용하기 쉬운 프로토콜이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 주요 에너지 기판의 산화 속도를 결정하는 데 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다. 중앙 우물을 포함하고 고무 마개14,15,16으로 덮인 플라스크를 사용하는 다른 프로토콜에 대한 간단한 대안입니다. 여기서 예시적인 연구가 세포 배양과 함께 수행되지만, 상기 방법은 앞서 기술된 바와 같이 무손상 미토콘드리아를…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금 R01 AR060456 (FL)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 마이클 로빈슨 박사와 엘리자베스 크리즈만(필라델피아 아동 병원)에게 섬광 카운터에 대한 아낌없는 도움을 주신 것에 감사드립니다.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
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