Vurdering av energisubstratoksidasjon in vitro med 14CO2-fangst
Summary
Denne protokollen beskriver en brukervennlig metode for å undersøke substratoksidasjon ved å spore 14CO2 produksjonsintro.
Abstract
Mitokondrier er vert for maskineriet for trikarboksylsyre (TCA) syklus og elektron transportkjede (ETC), som genererer adenosintrifosfat (ATP) for å opprettholde energi homeostase. Glukose, fettsyrer og aminosyrer er de viktigste energisubstratene som driver mitokondrie respirasjon i de fleste somatiske celler. Bevis viser at forskjellige celletyper kan ha en tydelig preferanse for visse substrater. Substratutnyttelse av ulike celler i skjelettet er imidlertid ikke studert i detalj. Videre, ettersom cellulær metabolisme er tilpasset fysiologiske og patofysiologiske endringer, kan direkte vurderinger av substratavhengighet i skjelettceller gi viktig innsikt i patogenesen av beinsykdommer.
Følgende protokoll er basert på prinsippet om karbondioksidfrigjøring fra substratmolekyler etter oksidativ fosforylering. Ved å bruke substrater som inneholder radioaktivt merkede karbonatomer (14C), gir metoden en sensitiv og brukervennlig analyse for substratoksidasjonsraten i cellekulturen. En casestudie med primære calvariale preosteoblaster versus benmargsavledede makrofager (BMMer) viser forskjellig utnyttelse av hovedsubstratene mellom de to celletypene.
Introduction
Oksidativ fosforylering (OXPHOS) i eukaryoter er prosessen der næringsstoffer brytes ned inne i mitokondrier for å frigjøre kjemisk energi i form av ATP gjennom forbruk av oksygen. Katabolisme av ulike substrater inne i mitokondrier gjennom trikarboksylsyre (TCA) syklusen genererer få ATP molekyler direkte, men lagrer heller energi gjennom reduksjon av elektron bærere nikotinamid adenin dinucleotide (NAD +) og flavin adenine dinucleotide (FAD +). De reduserte bærerne oksideres deretter av ETC plassert på den indre membranen av mitokondrier for å generere en protonkonsentrasjonsgradient over membranen. Protonene strømmer til slutt ned gradienten tilbake til mitokondriematrisen gjennom ATP-syntase for å produsere ATP. OXPHOS er den mest effektive måten å produsere ATP på fra energisubstrater og generelt foretrekkes i aerobe miljøer. Tidligere ble aerob glykolyseproduksjon av laktat fra glukose mens oksygen er tilstede- antatt å være patofysiologisk, ofte et kjennetegn på kreftceller. Mer og mer blir det oppdaget at noen normale celletyper bruker aerob glykolyse av grunner som ennå ikke er fullstendig dechiffrert.
Metabolsk fleksibilitet er kapasiteten for celler eller organismer til å tilpasse seg endrede energibehov og tilgjengelige drivstoffkilder. For eksempel blir den energiske etterspørselen av skjelettmuskulatur hovedsakelig møtt av OXPHOS ved steady state, men av anaerob glykolyse under høyintensitets trening1. Etter hvert som treningsvarigheten øker, bidrar glukose og fettsyreoksidasjon mer til den totale energiproduksjonen2. Substratbruk er imidlertid ikke bare avhengig av tilgjengelighet, da substrater antagonistisk konkurrerer under oksidasjon. Spesielt har fettsyreoksidasjon vist seg å hemme glukoseutnyttelse ved skjelettmuskulatur i et fenomen kjent som Randle-effekten3. En gjensidig effekt ble demonstrert ved senere studier 4,5. I tillegg er mange sykdommer forbundet med en endring i substratpreferanse og utvikling av metabolsk ufleksibilitet i celler. For eksempel reduseres fettsyreoksidasjon i skjelettmuskelen til type II diabetikerpasienter sammenlignet med normale kontrollpersoner6. De metabolske endringene i sykdomsmiljøer er gjenstand for intens undersøkelse, da de kan bidra til patogenese.
Energimetabolismen i skjelettcelletyper er relativt undervurdert, men har fått oppmerksomhet de siste årene7. Tidligere arbeid har vist at aerob glykolyse er den dominerende energiveien i kalori osteoblaster, mens glukoseoksidasjon gjennom TCA-syklusen spiller en rolle i osteoklastdannelse 8,9. Andre har gitt bevis for fettsyrer som energikilde for osteoblaster10. Glutamin katabolisme har også vist seg å støtte osteoblast differensiering fra forfedrene11,12. Imidlertid mangler en omfattende forståelse av substratutnyttelse av ulike skjelettcelletyper fortsatt. I tillegg forventes endringer i cellulær metabolisme under celledifferensiering eller som svar på patologiske signaler å endre bruken av drivstoffsubstrat. Beskrevet nedenfor er en brukervennlig protokoll for analyse av substratoksidasjonsintro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen gir en brukervennlig metode for å bestemme oksidasjonshastigheten til store energisubstrater. Det er et enklere alternativ til andre protokoller som bruker kolber som inneholder en sentral brønn og avkortet med gummipropper 14,15,16. Selv om eksempelstudien her utføres med cellekultur, kan metoden enkelt tilpasses vevseksempler eller vevshomogenater som inneholder intakt mitokondrier, som tidligere beskrevet<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble delvis støttet av NIH grant R01 AR060456 (FL). Vi takker Dr. Michael Robinson og Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) for deres generøse hjelp med scintillation counter.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
