Avaliação da oxidação do substrato de energia in vitro com 14armadilhas de CO2
Summary
Este protocolo descreve um método fácil de usar para examinar a oxidação do substrato rastreando a produção de 14CO2 in vitro.
Abstract
Mitocôndrias hospedam o maquinário para o ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte de elétrons (ETC), que geram triptosfato de adenosina (ATP) para manter a homeostase energética. Glicose, ácidos graxos e aminoácidos são os principais substratos de energia que alimentam a respiração mitocondrial na maioria das células somáticas. Evidências mostram que diferentes tipos de células podem ter uma preferência distinta por certos substratos. No entanto, a utilização do substrato por várias células no esqueleto não foi estudada em detalhes. Além disso, como o metabolismo celular está sintonizado com alterações fisiológicas e fisiodicos, avaliações diretas da dependência de substratos em células esqueléticas podem fornecer insights importantes sobre a patogênese das doenças ósseas.
O protocolo a seguir baseia-se no princípio da liberação de dióxido de carbono de moléculas de substrato após a fosforilação oxidativa. Ao usar substratos contendo átomos de carbono radioativos rotulados (14C), o método fornece um ensaio sensível e fácil de usar para a taxa de oxidação de substrato na cultura celular. Um estudo de caso com preosteoblasts primários do calvário versus macrófagos derivados da medula óssea (MMC) demonstra diferente utilização dos principais substratos entre os dois tipos de células.
Introduction
A fosforilação oxidativa (OXPHOS) em eucariotes é o processo pelo qual os nutrientes são divididos dentro das mitocôndrias para liberar energia química na forma de ATP através do consumo de oxigênio. O catabolismo de vários substratos dentro das mitocôndrias através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) gera poucas moléculas de ATP diretamente, mas armazena energia através da redução dos portadores de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) e dinucleotídeo de adenina flavin (FAD+). Os portadores reduzidos são então oxidados por ETC localizados na membrana interna das mitocôndrias para gerar um gradiente de concentração de prótons através da membrana. Os prótons eventualmente fluem de volta para a matriz mitocondrial através da synthase ATP para produzir ATP. Oxphos é o meio mais eficiente de produção de ATP a partir de substratos de energia e geralmente preferido em ambientes aeróbicos. Anteriormente, a produção de glicólise aeróbica de lactato a partir da glicose, enquanto o oxigênio está presente- pensava-se ser fiofosiológica, muitas vezes uma marca registrada das células cancerosas. Cada vez mais, está sendo descoberto que alguns tipos normais de células usam glicolise aeróbica por razões que ainda não foram totalmente decifradas.
Flexibilidade metabólica é a capacidade de células ou organismos se adaptarem às mudanças nas demandas energéticas e às fontes de combustível disponíveis. Por exemplo, a demanda energética do músculo esquelético é atendida principalmente pelo OXPHOS em estado estável, mas por glicólise anaeróbica durante o exercício de alta intensidade1. À medida que a duração do exercício aumenta, a oxidação da glicose e do ácido graxo contribuem mais para a produção global de energia2. No entanto, o uso de substrato não depende apenas da disponibilidade, pois substratos competem antagonistamente durante a oxidação. Mais notavelmente, a oxidação por ácidos graxos tem sido demonstrada para inibir a utilização da glicose pelo músculo esquelético em um fenômeno conhecido como efeito Randle3. Um efeito recíproco foi demonstrado pelos estudos subsequentes 4,5. Além disso, muitas doenças estão associadas à mudança na preferência por substrato e ao desenvolvimento da inflexibilidade metabólica nas células. Por exemplo, a oxidação por ácidos graxos é reduzida no músculo esquelético dos pacientes diabéticos tipo II em comparação com os sujeitos de controle normal6. As alterações metabólicas nos cenários da doença são objeto de intensa investigação, pois podem contribuir para a patogênese.
O metabolismo energético nos tipos de células esqueléticas é relativamente pouco estudado, mas ganhou atenção nos últimos anos7. Trabalhos anteriores mostraram que a glicólise aeróbica é a via de energia dominante nos osteoblastos calvariais, enquanto a oxidação da glicose através do ciclo TCA desempenha um papel na formação osteoclasta 8,9. Outros forneceram evidências de ácidos graxos como fonte de energia para os osteoblastos10. O catabolismo da glutamina também tem sido demonstrado para apoiar a diferenciação do osteoblasto dos progenitores11,12. No entanto, ainda falta uma compreensão abrangente da utilização de substratos por vários tipos de células esqueléticas. Além disso, espera-se que mudanças no metabolismo celular durante a diferenciação celular ou em resposta a sinais patológicos alterem a utilização do substrato de combustível. Descrito abaixo é um protocolo fácil de usar para avaliar a oxidação de substrato in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo fornece um método fácil de usar para determinar a taxa de oxidação dos principais substratos de energia. É uma alternativa mais simples a outros protocolos que usam frascos contendo um poço central e tampados com rolhas de borracha 14,15,16. Embora o exemplo de estudo aqui seja realizado com cultura celular, o método pode ser facilmente adaptado para explantos teciduais ou homogeneizadores de tecidos contendo …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado em parte pela concessão do NIH R01 AR060456 (FL). Agradecemos ao Dr. Michael Robinson e Elizabeth Krizman (Hospital Infantil da Filadélfia) por sua generosa ajuda com o contador de cintilação.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
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