Beoordeling van energiesubstraatoxidatie in vitro met 14CO2-vangst
Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudig te gebruiken methode om substraatoxidatie te onderzoeken door 14CO2-productie in vitro te volgen.
Abstract
Mitochondriën herbergen de machines voor de tricarbonzuur (TCA) cyclus en elektronentransportketen (ETC), die adenosinetrifosfaat (ATP) genereren om de energiehomeostase te behouden. Glucose, vetzuren en aminozuren zijn de belangrijkste energiesubstraten die mitochondriale ademhaling in de meeste somatische cellen voeden. Er zijn aanwijzingen dat verschillende celtypen een duidelijke voorkeur kunnen hebben voor bepaalde substraten. Substraatgebruik door verschillende cellen in het skelet is echter niet in detail bestudeerd. Bovendien, aangezien het cellulaire metabolisme is afgestemd op fysiologische en pathofysiologische veranderingen, kunnen directe beoordelingen van substraatafhankelijkheid in skeletcellen belangrijke inzichten verschaffen in de pathogenese van botziekten.
Het volgende protocol is gebaseerd op het principe van kooldioxide-afgifte uit substraatmoleculen na oxidatieve fosforylering. Door substraten te gebruiken die radioactief gelabelde koolstofatomen (14C) bevatten, biedt de methode een gevoelige en eenvoudig te gebruiken test voor de snelheid van substraatoxidatie in celkweek. Een casestudy met primaire calvariale preosteoblasten versus beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM’s) toont een verschillend gebruik van de belangrijkste substraten tussen de twee celtypen.
Introduction
Oxidatieve fosforylering (OXPHOS) in eukaryoten is het proces waarbij voedingsstoffen worden afgebroken in mitochondriën om chemische energie vrij te maken in de vorm van ATP door zuurstofverbruik. Katabolisme van verschillende substraten in mitochondriën via de tricarbonzuur (TCA) cyclus genereert weinig ATP-moleculen direct, maar slaat eerder energie op door reductie van de elektronendragers nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) en flavine adenine dinucleotide (FAD +). De gereduceerde dragers worden vervolgens geoxideerd door ETC op het binnenmembraan van mitochondriën om een protonconcentratiegradiënt over het membraan te genereren. De protonen stromen uiteindelijk hun gradiënt terug naar de mitochondriale matrix via ATP-synthase om ATP te produceren. OXPHOS is de meest efficiënte manier van ATP-productie uit energiesubstraten en heeft over het algemeen de voorkeur in aerobe omgevingen. Eerder werd gedacht dat aerobe glycolyse – productie van lactaat uit glucose terwijl zuurstof aanwezig is – pathofysiologisch was, vaak een kenmerk van kankercellen. Meer en meer wordt ontdekt dat sommige normale celtypen aerobe glycolyse gebruiken om redenen die nog niet volledig zijn ontcijferd.
Metabole flexibiliteit is het vermogen van cellen of organismen om zich aan te passen aan veranderende energiebehoeften en beschikbare brandstofbronnen. Aan de energetische vraag naar skeletspieren wordt bijvoorbeeld voornamelijk voldaan door OXPHOS in steady state, maar door anaerobe glycolyse tijdens intensieve training1. Naarmate de inspanningsduur toeneemt, dragen glucose- en vetzuuroxidatie meer bij aan de algehele energieproductie2. Substraatgebruik is echter niet alleen afhankelijk van beschikbaarheid, omdat substraten antagonistisch concurreren tijdens oxidatie. Met name is aangetoond dat vetzuuroxidatie het glucosegebruik door skeletspieren remt in een fenomeen dat bekend staat als het Randle-effect3. Een wederkerig effect werd aangetoond door latere studies 4,5. Bovendien worden veel ziekten geassocieerd met een verandering in substraatvoorkeur en de ontwikkeling van metabole inflexibiliteit in cellen. Vetzuuroxidatie is bijvoorbeeld verminderd in de skeletspieren van type II diabetespatiënten in vergelijking met normale controlepersonen6. De metabole veranderingen in ziekte-instellingen zijn een onderwerp van intensief onderzoek omdat ze kunnen bijdragen aan de pathogenese.
Het energiemetabolisme in skeletceltypen is relatief onderbelicht, maar heeft de laatste jaren aandacht gekregen7. Eerder werk heeft aangetoond dat aerobe glycolyse de dominante energieroute is in calvariale osteoblasten, terwijl glucose-oxidatie via de TCA-cyclus een rol speelt bij osteoclastenvorming 8,9. Anderen hebben bewijs geleverd voor vetzuren als energiebron voor osteoblasten10. Glutaminekatabolisme heeft ook aangetoond dat het osteoblastdifferentiatie van de voorlopersondersteunt 11,12. Een uitgebreid begrip van substraatgebruik door verschillende skeletceltypen ontbreekt echter nog steeds. Bovendien wordt verwacht dat veranderingen in het cellulaire metabolisme tijdens celdifferentiatie of als reactie op pathologische signalen het gebruik van brandstofsubstraat zullen veranderen. Hieronder wordt een eenvoudig te gebruiken protocol beschreven voor het testen van substraatoxidatie in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol biedt een eenvoudig te gebruiken methode om de oxidatiesnelheid van belangrijke energiesubstraten te bepalen. Het is een eenvoudiger alternatief voor andere protocollen die kolven gebruiken die een centrale put bevatten en afgedekt zijn met rubberen stoppen 14,15,16. Hoewel de voorbeeldstudie hier wordt uitgevoerd met celkweek, kan de methode gemakkelijk worden aangepast voor weefselexplantaten of weefselhomogenaten…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidie R01 AR060456 (FL). We bedanken Dr. Michael Robinson en Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) voor hun genereuze hulp bij de sprankelende teller.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
