Vurdering af oxidation af energisubstrat in vitro med 14CO2 - fangst
Summary
Denne protokol beskriver en brugervenlig metode til at undersøge substratoxidation ved at spore 14CO2 –produktion in vitro.
Abstract
Mitokondrier er vært for maskineriet til tricarboxylsyre (TCA) cyklus og elektrontransportkæde (ETC), som genererer adenosintrifosfat (ATP) for at opretholde energihomeostase. Glukose, fedtsyrer og aminosyrer er de vigtigste energisubstrater, der brænder mitokondriel respiration i de fleste somatiske celler. Beviser viser, at forskellige celletyper kan have en særskilt præference for visse substrater. Imidlertid er substratudnyttelse af forskellige celler i skelettet ikke blevet undersøgt i detaljer. Da cellulær metabolisme er tilpasset fysiologiske og patofysiologiske ændringer, kan direkte vurderinger af substratafhængighed i skeletceller desuden give vigtig indsigt i patogenesen af knoglesygdomme.
Følgende protokol er baseret på princippet om frigivelse af kuldioxid fra substratmolekyler efter oxidativ phosphorylering. Ved at anvende substrater, der indeholder radioaktivt mærkede carbonatomer (14C), tilvejebringer metoden et følsomt og brugervenligt assay for hastigheden af substratoxidation i cellekultur. Et casestudie med primære kalvariale preosteoblaster versus knoglemarvsafledte makrofager (BMM’er) viser forskellig udnyttelse af hovedsubstraterne mellem de to celletyper.
Introduction
Oxidativ fosforylering (OXPHOS) i eukaryoter er den proces, hvorved næringsstoffer nedbrydes inde i mitokondrier for at frigive kemisk energi i form af ATP gennem forbrug af ilt. Katabolisme af forskellige substrater inde i mitokondrier gennem tricarboxylsyre (TCA) cyklus genererer få ATP molekyler direkte, men lagrer snarere energi gennem reduktion af elektronbærerne nicotinamid adenin dinukleotid (NAD +) og flavinadenin dinukleotid (FAD +). De reducerede bærere oxideres derefter af ETC placeret på mitokondriernes indre membran for at generere en protonkoncentrationsgradient over membranen. Protonerne strømmer til sidst ned ad deres gradient tilbage i mitokondrielle matrix gennem ATP-syntase for at producere ATP. OXPHOS er det mest effektive middel til ATP-produktion fra energisubstrater og foretrækkes generelt i aerobe miljøer. Tidligere blev aerob glykolyse – produktion af laktat fra glukose, mens ilt er til stede – anset for at være patofysiologisk, ofte et kendetegn for kræftceller. Mere og mere opdages det, at nogle normale celletyper bruger aerob glykolyse af grunde, der endnu ikke er fuldt dechiffreret.
Metabolisk fleksibilitet er cellers eller organismers evne til at tilpasse sig skiftende energibehov og tilgængelige brændstofkilder. For eksempel imødekommes den energiske efterspørgsel efter skeletmuskulatur hovedsageligt af OXPHOS ved steady state, men af anaerob glykolyse under træning med høj intensitet1. Efterhånden som træningsvarigheden øges, bidrager glukose og fedtsyreoxidation mere til den samlede energiproduktion2. Imidlertid er substratbrug ikke kun afhængig af tilgængelighed, da substrater antagonistisk konkurrerer under oxidation. Mest bemærkelsesværdigt har fedtsyreoxidation vist sig at hæmme glukoseudnyttelsen af skeletmuskulaturen i et fænomen kendt som Randle-effekten3. En gensidig effekt blev påvist ved efterfølgende undersøgelser 4,5. Derudover er mange sygdomme forbundet med en ændring i substratpræference og udviklingen af metabolisk ufleksibilitet i celler. For eksempel reduceres fedtsyreoxidation i skeletmuskulaturen hos type II-diabetespatienter sammenlignet med normale kontrolpersoner6. De metaboliske ændringer i sygdomsindstillinger er genstand for intens undersøgelse, da de kan bidrage til patogenese.
Energimetabolisme i skeletcelletyper er relativt underundersøgt, men har fået opmærksomhed i de senere år7. Tidligere arbejde har vist, at aerob glykolyse er den dominerende energivej i kalvariale osteoblaster, mens glukoseoxidation gennem TCA-cyklussen spiller en rolle i osteoklastdannelse 8,9. Andre har fremlagt beviser for fedtsyrer som energikilde til osteoblaster10. Glutaminkatabolisme har også vist sig at understøtte osteoblastdifferentiering fra forfædrene11,12. Imidlertid mangler der stadig en omfattende forståelse af substratudnyttelse af forskellige skeletcelletyper. Derudover forventes ændringer i cellulær metabolisme under celledifferentiering eller som reaktion på patologiske signaler at ændre udnyttelsen af brændstofsubstratet. Beskrevet nedenfor er en brugervenlig protokol til analyse af substratoxidation in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen giver en brugervenlig metode til at bestemme oxidationshastigheden for større energisubstrater. Det er et enklere alternativ til andre protokoller, der bruger kolber, der indeholder en central brønd og er dækket af gummipropper 14,15,16. Selvom eksempelstudiet her udføres med cellekultur, kan metoden let tilpasses vævseksplanter eller vævshomogenater indeholdende intakte mitokondrier, som tidligere beskrevet<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev delvist støttet af NIH-bevilling R01 AR060456 (FL). Vi takker Dr. Michael Robinson og Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) for deres generøse hjælp med scintillationstælleren.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
