Étude de la régénération tissulaire sans cicatrices dans les cornées de poussins embryonnaires blessés

Summary

Le présent protocole démontre les différentes étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire in ovo. Les cornées régénérantes ou entièrement restaurées peuvent être analysées pour leur potentiel de régénération à l’aide de diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure.

Abstract

Les plaies cornéennes embryonnaires de poussins présentent une capacité remarquable à se régénérer complètement et rapidement, tandis que les cornées blessées adultes subissent une perte de transparence due à des cicatrices fibrotiques. L’intégrité tissulaire des cornées embryonnaires blessées est intrinsèquement restaurée sans formation de cicatrice détectable. Compte tenu de son accessibilité et de sa facilité de manipulation, l’embryon de poussin est un modèle idéal pour étudier la réparation des plaies cornéennes sans cicatrice. Ce protocole démontre les différentes étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire en ovo. Tout d’abord, les œufs sont fenêtrés au début de l’âge embryonnaire pour accéder à l’œil. Deuxièmement, une série de manipulations in ovo physiques des membranes extraembryonnaires sont effectuées pour assurer le maintien de l’accès à l’œil jusqu’aux stades ultérieurs de développement, correspondant au moment où les trois couches cellulaires de la cornée sont formées. Troisièmement, les plaies cornéennes linéaires qui pénètrent dans la couche épithéliale externe et le stroma antérieur sont fabriquées à l’aide d’un couteau microchirurgical. Le processus de régénération ou les cornées entièrement restaurées peuvent être analysés pour le potentiel de régénération en utilisant diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure. Les études à ce jour utilisant ce modèle ont révélé que les cornées embryonnaires blessées présentent une activation de la différenciation kératocytaire, subissent un remodelage coordonné des protéines ECM à leur macrostructure tridimensionnelle native et sont réintricées de manière adéquate par les nerfs sensoriels cornéens. À l’avenir, l’impact potentiel des facteurs endogènes ou exogènes sur le processus de régénération pourrait être analysé dans la guérison des cornées en utilisant des techniques de biologie du développement, telles que la greffe de tissus, l’électroporation, l’infection rétrovirale ou l’implantation de billes. La stratégie actuelle identifie le poussin embryonnaire comme un paradigme expérimental crucial pour élucider les facteurs moléculaires et cellulaires coordonnant la cicatrisation des plaies cornéennes sans cicatrice.

Introduction

La cornée est le tissu transparent et le plus externe de l’œil qui transmet et réfracte la lumière propice à l’acuité visuelle. Dans la cornée adulte, des dommages ou une infection du stroma cornéen entraînent une réponse rapide et robuste à la cicatrisation des plaies caractérisée par une prolifération kératocytaire, une fibrose, une inflammation accrue conduisant à une apoptose induite par les cytokines, la génération de myofibroblastes réparateurs et un remodelage global de la matrice extracellulaire (ECM)^1,2 . Après une blessure, une telle réparation du tissu cornéen entraîne un tissu cicatriciel opaque qu....

Protocol

La souche d’œufs utilisée dans ce protocole était White Leghorn, et toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Illinois Wesleyan University.

1. Incubation des œufs de poussins

1. Gardez les œufs à ~10 °C jusqu’à 1 semaine après leur ponte pour arrêter le développement. Lorsque vous êtes prêt à lancer le développement de l’embryon de poussin, essuyez toute la coquille d’œuf avec des lingettes non pelucheuses (voir tableau des matériaux) saturées d’eau à température ambiante pour éliminer la saleté et les débris.
2. A....

Results

À la suite de la dissection antérieure de l’ACM et du CAM à E5.5 pour exposer la région crânienne de l’embryon en développement, une série de lacérations qui couvraient la cornée centrale E7 a été faite en ovo (Figure 1). Une plaie idéale pour étudier la régénération de la cornée se produit après trois lacérations, chacune faite au même endroit de la cornée. La première lacération traverse l’épithélium cornéen, tandis que les deuxième et troisième lacérations pénètrent respectivemen.......

Discussion

Le poussin est un système modèle idéal pour étudier la réparation des plaies cornéennes fœtales et sans cicatrice. Contrairement aux mammifères, le poussin est facilement accessible tout au long du développement en utilisant les stratégies in ovo⁸ ou ex ovo ²⁴. La cornée embryonnaire du poussin est beaucoup plus grande que les cornées de rongeurs, avec près de 50% du volume crânien dédié à l’œil²⁵, ce qui la rend très sensible aux m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aiguille hypodermique de 18 g	Fisher Scientific	14-826-5D
Couteau de microdissection à 30 degrés	Fine Science Tools	10056-12
4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Sondes moléculaires	D1306
Seringue de 5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
Anticorps	secondaires marqués au fluor AlexaSondes
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2-H20)	Sigma	C8106
Plateaux à œufs de poule	GQF	O246
Pince à dissectionner, pointe fine, dentelée	VWR	82027-408
Ciseaux à dissectionner, pointe acérée	VWR	82027-578
Iris 1 x 2 Dents Tissu Pince courbée	VWR	100494-908
Ciseaux de microdissection		VWR 470315-228
Anti-fibronectine de souris (IgG1)	Etudes de développement Banque d’hybridomes	B3/D6
Anti-laminine de souris (IgG1)	Etudes de développement Banque d’hybridomes	3H11
Protéine bêta-tubuline spécifique aux antineurones de souris (Tuj1, IgG2a)	Biolegend	801213
Anti-ténascine de souris (IgG1)	Etudes développementales Banque d’hybridomes	M1-B4
Paraformaldéhyde	Sigma	158127
Pénicilline/Streptomycine	Sigma	P4333
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma	P5405
Chlorure de sodium (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Sportsman 1502 incubateur d’œufs	GQF	1502
Déchirable à la main (largeur 1,88 pouce)	Scotch	n/a