Protokollen, der præsenteres her, tillader transplantation af induceret pluripotent stamcelleafledt human microglia (iPSMG) i hjernen via en transnasal vej i immunkompetente mus. Fremgangsmåden til fremstilling og transnasal transplantation af celler og administration af cytokinblanding til opretholdelse af iPSMG er vist.
Microglia er den specialiserede population af makrofaglignende celler i hjernen. De spiller væsentlige roller i både fysiologiske og patologiske hjernefunktioner. Det meste af vores nuværende forståelse af microglia er baseret på eksperimenter udført i musen. Human microglia adskiller sig fra musemikroglia, og derfor kan respons og egenskaber ved musemikroglia ikke altid repræsentere den for human microglia. På grund af etiske og tekniske vanskeligheder er forskning i human microglia desuden begrænset til in vitro-dyrkningssystem , som ikke kapitulerer in vivo-karakteristika ved microglia. For at overvinde disse problemer udvikles en forenklet metode til ikke-invasivt transplantation af induceret pluripotent stamcelleafledt human microglia (iPSMG) i den immunkompetente musehjerne via en transnasal vej i kombination med farmakologisk udtømning af endogen mikroglia ved hjælp af en kolonistimulerende faktor 1-receptor (CSF1R) antagonist. Denne protokol giver mulighed for ikke-invasivt at transplantere celler ind i musehjernen og kan derfor være værdifuld til evaluering af den in vivo-rolle , som human microglia spiller i fysiologiske og patologiske hjernefunktioner.
Microglia er en specialiseret population af makrofaglignende celler i centralnervesystemet (CNS) og spiller væsentlige roller i at kontrollere forskellige hjernefunktioner som neural kredsløbsudvikling, modulering af neurotransmission og opretholdelse af hjernens homeostase 1,2,3. Selvom murine microglia deler mange funktioner med dem fra mennesker, viser de artsspecifikke forskelle. Således kan reaktionen fra musemikroglia på forskellige stimuli ikke altid repræsentere den for human microglia 4,5,6. Selvom mange undersøgelser har analyseret human microglia, er disse eksperimenter begrænset til in vitro-undersøgelser. In vitro-dyrkede humane mikroglia viser morfologiske træk og genekspression, der er meget forskellige fra dem in vivo. In vitro-eksperimenter kan således ikke altid kapitulere in vivo-egenskaberne ved human microglia. Derfor er der behov for et eksperimentelt system til undersøgelse af human microglia in vivo.
For nylig, for at studere in vivo-egenskaberne ved human microglia, transplanteres in vitro-genererede inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) – eller embryonale stamceller – afledte humane mikroglia kirurgisk i musehjernen 7,8,9,10,11,12,13,14. Ved hjælp af denne tilgang er forskellige in vivo-træk ved human microglia blevet karakteriseret. Den udbredte anvendelse af denne metode er imidlertid begrænset af to grunde. For det første er kravet om immunmangelfulde mus. For at studere den menneskelige mikroglias rolle i forskellige neurodegenerative sygdomme skal sygdomsmutationsbærende mus således krydses til immunmangelfulde mus, hvilket kræver betydelig tid og kræfter. Desuden kan perifere immunceller, som T-celler, i forskellige neurologiske lidelser modulere mikrogliale funktioner 15,16,17. Derfor repræsenterer eksperimenter udført på immunmangelfulde mus muligvis ikke bona fide egenskaber ved human microglia in vivo. For det andet kræver invasive operationer til transplantation af mikroglia yderligere udstyr og træning. Endvidere kan hjerneskade under invasiv transplantation ændre mikrogliafænotyper.
I denne protokol beskrives ikke-invasiv transnasal transplantation (Tsn) af iPSMG i immunkompetente vildtypemus18. Ved at kombinere farmakologisk ON/OFF af en CSF1R-antagonist PLX5622, som udtømmer endogen musemikroglia19 og Tsn, kan iPSMG ikke-invasivt transplanteres i musehjernen. Ved anvendelse af eksogent humant cytokin forbliver det transplanterede iPSMG desuden levedygtigt i 60 dage på en regionsspecifik måde uden immunsuppressive midler.
Protokollen her beskriver den ikke-invasive transplantation af iPSMG i musehjernen. Det unikke ved den nuværende protokol er, at ved at kombinere farmakologiske PLX ON/OFF-metoder og intranasal transplantation kan iPSMG ikke-invasivt transplanteres ind i den immunkompetente musehjerne. Transplanteret iPSMG dannede størstedelen af microglia i hippocampus og cerebellum ved at besætte den ledige niche i op til 60 dage, men ikke i cortex.
De kritiske punkter for den effektive Tsn af iPSMG er (i) udtømningseffektiviteten af endogen musemikroglia (ii) administration af humane cytokiner hver 12. time. Microglia opretholder deres eget territorium i hjernen. Effektiv udtømning af musemikroglia er nødvendig for at tilvejebringe en niche til indkapslelse af transplanteret iPSMG. Når udtømning af endogen musemikroglia er utilstrækkelig, observeres kolonisering af musens hippocampus og cerebellum af iPSMG ikke. Mikroglias levedygtighed afhænger af CSF1R og TGFBR, der signalerer 19,21,22. hCSF1 rapporteres selektivt at øge levedygtigheden af human microglia, og hTGF-β1 er nødvendig for mikroglias levedygtighed samt dæmper inflammation, når den administreres hver 12. time 21,23,24. I mangel af eksogene humane cytokiner observeres iPSMG ikke i musehjernen. Endvidere skal man være opmærksom på ikke mekanisk at aktivere iPSMG ved overdreven pipettering eller på anden måde før Tsn, da det uigenkaldeligt ændrer iPSMG-egenskaber såvel som transplantationseffektivitet. Hvis den tilfredsstillende Tsn af iPSMG ikke ses, skal iPSMG’s levedygtighed før transplantation samt udtømning af endogen mikroglia bestemmes. Hvis udtømningen af endogen musemikroglia ikke er på over 90 %, kan PLX5622-fodringstiden ændres for at øge udtømningen.
Sammenlignet med en konventionel kirurgisk transplantationsmetode, der er invasiv og kræver ekstra udstyr og træning, tillader Tsn transplantation på en ikke-invasiv, enkel, stabil og nem måde. Desuden tillader denne metode transplantation af iPSMG i immunkompetente musehjerner; således kan immunkompetente sygdomsmodelmus bruges til at studere responsen fra iPSMG.
Den største ulempe ved den nuværende metode er den regionale heterogenitet i engraftmentet af iPSMG. Hvis den hjerneområdespecifikke iPSMG-transplantation er påkrævet, er den nuværende protokol ikke egnet, da den transplanterede iPSMG kun forbliver indpodet i 60 dage i hippocampus og cerebellum, men ikke i cortex. Endvidere er behovet for at administrere eksogene humane cytokiner intranasalt hver 12. time også en begrænsning af den nuværende protokol, da den kræver omfattende arbejdskraft og er dyr.
Afslutningsvis tilvejebringes en detaljeret protokol for Tsn af iPSMG i hjernen hos immunkompetente mus. Når det kombineres med farmakologisk ON/OFF af musemikroglia af PLX5622, tillader denne protokol en vellykket engraftment af iPSMG. Da transplanterede celler kan observeres i hippocampus og cerebellum i en vedvarende periode, når eksogene cytokiner anvendes, kan den nuværende metode være værdifuld til evaluering af den menneskelige mikroglias rolle i både fysiologiske og patologiske tilstande i disse regioner.
The authors have nothing to disclose.
Tilskudssponsorer: Denne undersøgelse blev støttet af JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), Mitsubishi Science Foundation (SK), Takeda Science Foundation (SK) og et Frontier Brain Science Grant fra University of Yamanashi (SK).
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10566 | |
AIN 93G | Oriental Yeast Co | ||
Anti-Iba1 antibody | FUJIFILM | 019–19741 | |
Anti-STEM121 antibody | Takara Bioscience | Y40410 | |
Butorphanol tartrate | Kyoritsu Seiyaku | 8019 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | |
Frozen iPSMG | Shionogi & Co., Ltd | Laboratory for Drug Discovery and Disease Research | |
Human colony stimulating factor 1 (hCSF1) | PeproTech | 300-25 | |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 | |
Medetomidine hydrochloride | Meiji Seika | VETLI5 | |
Midazolam | Astellas | 18005A2 | |
Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 162-16065 | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
Pipette tip | Eppendorf | 30076028 | |
PLX5622 | Amadis Chemical | A930097 | |
Transforming growth factor-β1 (Tgf-b1) | PeproTech | 100-21 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400-10 | antifade mounting medium |