菌根图谱作为探索红费斯图卡和玉米根部定植模式和真菌策略的工具
Summary
这里的协议描述了评估丛枝菌根定植模式的方法和两个物种的根策略： Zea mays 和 Festuca rubra。MycoPatt方法的使用允许计算参数，将菌根结构转换为数字数据，以及绘制它们在根中的真实位置。
Abstract
丛枝菌根真菌是植物根部的共生体。它们的作用是维持宿主发育和维持生态系统中的营养平衡。定植过程取决于几个因素，如土壤生态、真菌和宿主的遗传多样性以及农艺实践。它们的同步作用导致复杂的菌丝网络的发展，并导致根细胞中囊泡和丛枝的二次发育。本研究的目的是分析菌根模式（MycoPatt）方法在 红费斯图卡 和 玉米根部定位真菌结构的效率。另一个目标是探索每个物种的菌根图所揭示的真菌定植策略。多个显微图像的采集和组合允许玉米和红羊茅植物的菌根定植评估，以提供有关发达结构的实际位置的信息。观察到的菌根模式突出了每种植物在与土壤共生真菌建立联系方面的不同效率，这是由应用处理和生长阶段引起的。通过MycoPatt方法获得的菌根详细图谱可用于早期检测从土壤中共生获取的植物效率。
Introduction
丛枝菌根（AM）真菌是一类土壤传播的内生菌，一直是研究人员感兴趣的领域。它们存在于大多数植物的根部并参与营养循环，使它们成为存在草本植物的每个生态系统稳定性的重要组成部分1，2。通过其神经根外菌丝体，AM可作为植物根系的真菌延伸，特别是在难以到达的地区3。主要活动是在寄主植物根部，AM在其中发展出大型菌丝网络和称为丛枝的特定细胞内结构。宿主特异性的缺乏使共生体能够同时定植多个物种。这种能力为AM提供了生态系统中资源分配和养分调节的作用;真菌还为植物生存提供支持，并有助于植物性能4，5，6，7。AM物种对宿主根的反应在神经根内菌丝体的延伸和位置以及细胞内发育的丛枝的存在和形状中可见。细胞内丛枝作为两个共生体之间的交换点，代表以快速转移过程为特征的区域。AM产生的结构是物种依赖性的，除了丛枝外，在根部，它们还发育囊泡，孢子和辅助细胞。
植物根系AM共生体的评估存在许多挑战8，9。首先是它们在整个寄主植被时期的不断发展，导致菌丝丛枝结构发生多重变化。丛枝生长的不同阶段，直到它们的崩溃，明显存在于根部，但衰老的AM结构有时会被消化，这使得它们只能部分可见10。第二个挑战是染色方法和方案，根系的多样性，细胞的尺寸以及厚度的差异，这使得很难提出统一的方法。最后一个挑战是AM定植的评估和评分。有许多方法可以对AM进行不同程度的客观性评分，其中大多数仍然仅限于显微镜技术。简单的是基于根皮层中结构的存在/不存在，而更复杂的是基于视觉评分和定植类的使用，并整合了定植现象的频率和强度。在过去的几十年里，已经产生了大量关于多个物种菌根状态的数据，但大多数方法仅限于定植的观察值，而没有指出根皮层中每个结构的真实位置。为了应对更准确的AM定植结果的必要性，开发了一种基于根系菌根模式显微镜分析（MycoPatt）的方法，以数字形式组装详细的菌根图谱11。此外，该方法允许客观计算定植参数并确定根中每个结构的实际位置。
AM真菌结构的位置对于回答以下两个问题很重要。第一个与植物植被周期中某一特定时刻的定植分析有关。在这种情况下，观察丛枝/囊泡丰度，报告它们在根中的位置，并提供非常清晰的定植图像和参数非常有用。第二个与真菌策略的检测及其取向甚至对其未来发展的预测有关。MycoPatt 的一种应用可以用于每天、每 2-3 天、每周或在不同生长阶段分析的植物。在这种情况下，囊泡/丛枝的位置对于更好地了解AM定植的生物学机制非常重要。这些参数和观察结果对于补充数学参数非常有用。
本文的目的是展示MycoPatt系统在不同发育阶段的玉米根和不同长期受精条件下的红羊茅根中探索天然AM真菌定植潜力和策略的能力。为了实现这个目标，分析了来自两个实验的两个大型数据库。玉米实验在Cojocna（北纬46°44′56“，长23°50′0”）建立。E），在农业科学和兽医大学克卢日的实验教学农场中，在具有壤质土壤的 phaeoziom 上12.红羊茅实验是2001年在阿普塞尼山脉Gheśari（北纬46°49’064“，长22°81’418”）建立的大型实验场的一部分。E），在前卢沃索尔（土地罗萨）土壤类型13，14上。以5种不同的生长形态12收集玉米：B1 = 2-4叶（作为菌根定植开始的控制点）;B2 = 6 片叶子;B3 = 8-10 叶;B4 = 玉米芯形成;B5 = 生理成熟度。从2-4叶阶段（A0）开始，应用有机处理，产生两个分级因子（A1 =对照和A2 =处理）。在开花时从五次长期施肥实验中收集红羊茅的根13，14：V1 =对照，未受精;V2 = 10 t·ha-1 粪肥;V3 = 10 t·ha-1 粪肥 + N 50 kg·ha-1， P 2 O5 25 kg·ha-1， K2O 25 kg·ha-1;V4 = N 100 kg·ha-1， P 2 O5 50 kg·ha-1， K2O 50 kg·ha-1;V5 = 10 t·ha-1 粪肥 + N 100 kg·ha-1， P 2 O5 50 kg·ha-1， K2O 50 kg·ha-1.在每个发育阶段从每个施肥变体中收集五株植物。分析了染色方案及其在样品处理时间和染色质量方面的性能。分别分析了每个物种的AM菌丝发育与其根部结构存在之间的关系，并继续确定最宽松的根进行定植。基于定植图谱和AM参数值分析各根系的具体定植模式。
玉米是一年生植物，这意味着根系的持续生长，这是在生长阶段使用MycoPatt的主要原因。红羊茅是一种来自草原的多年生植物，经过长时间的不同肥料处理。它的根部发育较短，为1年，当植物的新陈代谢从营养转变为生成时，开花被认为是植被点。为了在这些激烈的活动期间捕捉这些植物，选择了上述时间点。在天然草原上生长时，该物种很难在植被期取样。
Protocol
Representative Results
Discussion
菌根定植研究对于农艺领域的新战略制定至关重要。多种栽培植物与丛枝菌根形成共生联系的潜力使它们成为农业生态系统可持续发展和维持其健康的重要组成部分16，17，18，19，20。因此，有必要更好地了解定植机制和真菌策略，这提供了关于植物如何与土壤营养网络、产?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本文使用了由Victoria Pop-Moldovan进行的“农艺投入驱动的玉米菌根模式”专题领域的两项博士研究得出的数据，以及由Larisa Corcoz在Roxana Vidican教授博士的协调下进行的“山地草原优势物种的菌根现状和定植发展”。
Materials
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26×76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
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