Mycorrhiza-kaarten als hulpmiddel om kolonisatiepatronen en schimmelstrategieën in de wortels van Festuca rubra en Zea mays te verkennen
Summary
Het protocol beschrijft hier de methoden voor de beoordeling van de arbusculaire mycorrhiza kolonisatiepatronen en strategie in wortels voor twee soorten: Zea mays en Festuca rubra. Het gebruik van de MycoPatt-methode maakt de berekening van parameters, de conversie van mycorrhizastructuren in digitale gegevens en het in kaart brengen van hun werkelijke positie in wortels mogelijk.
Abstract
Arbusculaire mycorrhizaschimmels zijn symbionten in de wortels van planten. Hun rol is om de ontwikkeling van de gastheer te ondersteunen en het voedingsevenwicht in de ecosystemen te behouden. Het kolonisatieproces is afhankelijk van verschillende factoren zoals bodemecologie, de genetische diversiteit van de schimmels en gastheer en agronomische praktijken. Hun gesynchroniseerde werking leidt tot de ontwikkeling van een complex hyphal netwerk en leidt tot de secundaire ontwikkeling van blaasjes en arbuscules in de wortelcellen. Het doel van dit onderzoek was om de efficiëntie van de mycorrhizapatronen (MycoPatt) methode te analyseren voor de positionering van schimmelstructuren in de wortels van Festuca rubra en Zea mays. Een ander doel was om de schimmelkolonisatiestrategie te verkennen, zoals onthuld door mycorrhiza-kaarten van elke soort. De verwerving en assemblage van meerdere microscopische beelden maken mycorrhiza kolonisatiebeoordeling in zowel maïs- als roodzwenkgrasplanten mogelijk om informatie te geven over de realistische positie van de ontwikkelde structuren. De waargenomen mycorrhizapatronen benadrukken de variabele efficiëntie van elke plant in termen van het ontwikkelen van verbindingen met bodemsymbiotische schimmels, veroorzaakt door toegepaste behandelingen en groeifase. Mycorrhiza gedetailleerde kaarten verkregen via de MycoPatt-methode zijn nuttig voor de vroege detectie van plantefficiëntie in symbiotische acquisitie uit de bodem.
Introduction
Arbusculaire mycorrhiza (AM) schimmels zijn een categorie van bodemgedragen endofyten die voortdurend een interessegebied zijn voor onderzoekers. Hun aanwezigheid in de wortels van de meeste planten en hun betrokkenheid bij voedingscycli maakt ze vitale componenten in de stabiliteit van elk ecosysteem waar kruidachtige planten aanwezig zijn 1,2. Door hun extra radiculair mycelium fungeert AM als een schimmelverlenging voor plantenwortels, vooral in moeilijk bereikbare gebieden3. De hoofdactiviteit is in de wortels van waardplanten, waar AM grote schimmeldradennetwerken en specifieke intracellulaire structuren ontwikkelt die arbuscules worden genoemd. Het gebrek aan gastheerspecificiteit stelt de symbiont in staat om meerdere soorten tegelijkertijd te koloniseren. Dit vermogen biedt AM de rol van toewijzing van hulpbronnen en regulering van voedingsstoffen in het ecosysteem; de schimmel biedt ook ondersteuning bij het overleven van planten en helpt bij de prestaties van de plant 4,5,6,7. De reactie van AM-soorten op gastheerwortels is zichtbaar in de extensie en locatie van het intra-radiculaire mycelium en de aanwezigheid en vorm van de arbuscules die intracellulair zijn ontwikkeld. De intracellulaire arbuscules fungeren als een uitwisselingspunt tussen de twee symbionten en vertegenwoordigen gebieden die worden gekenmerkt door snelle overdrachtsprocessen. De structuren die de AM produceren zijn soortafhankelijk en ontwikkelen naast arbuscules in de wortels ook blaasjes, sporen en hulpcellen.
Er zijn veel uitdagingen bij de beoordeling van AM-symbionten in plantenwortels 8,9. De eerste is hun constante ontwikkeling gedurende de hele vegetatieperiode van gastheren, wat leidt tot meerdere veranderingen in de hyphal arbusculaire structuur. De verschillende stadia van arbusculaire groei, tot hun ineenstorting, zijn duidelijk aanwezig in wortels, maar de senescente AM-structuren worden soms verteerd, waardoor ze slechts gedeeltelijk zichtbaar zijn10. De tweede uitdaging wordt vertegenwoordigd door de kleuringsmethode en het protocol, de grote diversiteit van wortelsystemen, de dimensie van hun cellen en de verschillen in dikte, waardoor het moeilijk is om een uniforme methode voor te stellen. De laatste uitdaging wordt vertegenwoordigd door de beoordeling en scoring van AM-kolonisatie. Er zijn talloze methoden die AM scoren met verschillende gradaties van objectiviteit, en de meeste zijn nog steeds beperkt tot microscopietechnieken. De eenvoudige zijn gebaseerd op de aanwezigheid / afwezigheid van structuren in de wortelschors, terwijl de meer complexe zijn gebaseerd op visuele scoring en het gebruik van kolonisatieklassen, met de integratie van de frequentie en intensiteit van het kolonisatiefenomeen. Er zijn de afgelopen decennia veel gegevens geproduceerd over de mycorrhiza-status van meerdere soorten, maar de meeste methoden zijn beperkt tot de waargenomen waarde van kolonisatie zonder te wijzen op de werkelijke positie van elke structuur in de wortelschors. Als antwoord op de noodzaak van nauwkeurigere resultaten over AM-kolonisatie, werd een methode ontwikkeld op basis van microscopische analyse van mycorrhizapatronen (MycoPatt) in wortels om in digitale vorm de gedetailleerde mycorrhiza-kaarten samen te stellen11. Ook maakt de methode de objectieve berekening van kolonisatieparameters en de bepaling van de werkelijke positie van elke structuur in de wortel mogelijk.
De positie van de AM-schimmelstructuren kan belangrijk zijn bij het beantwoorden van de volgende twee vragen. De eerste heeft betrekking op de analyse van de kolonisatie op één specifiek moment uit de vegetatiecyclus van een plant. In deze context is het zeer nuttig om de arbusculaire / blaasjesrijkdom te observeren, te rapporteren hoe ze zich in de wortel bevinden en een zeer duidelijk kolonisatiebeeld en parameters te geven. De tweede heeft betrekking op de detectie van schimmelstrategie en de oriëntatie ervan en zelfs de voorspelling van de toekomstige ontwikkeling ervan. Een toepassing van de MycoPatt kan zijn voor planten die dagelijks, elke 2-3 dagen, wekelijks of tijdens verschillende groeistadia worden geanalyseerd. In deze context is de locatie van de blaasjes / arbuscules belangrijk om het biologische mechanisme van AM-kolonisatie beter te begrijpen. Deze parameters en waarnemingen zijn zeer nuttig om de wiskundige parameters aan te vullen.
Het doel van dit artikel is om het vermogen van het MycoPatt-systeem aan te tonen om het inheemse AM-schimmelkolonisatiepotentieel en -strategie in Zea mays (maïs) wortels tijdens verschillende ontwikkelingsstadia en in Festuca rubra (rood zwenkgras) wortels onder verschillende langdurige bevruchtingsomstandigheden te verkennen. Om het doel te bereiken, werden twee grote databases van twee experimenten geanalyseerd. Het maïsexperiment werd opgezet in Cojocna (46°44′56″ lat. N en 23°50′0″ lang. E), in de Experimentele Didactische Boerderij van de Universiteit voor Landbouwwetenschappen en Diergeneeskunde Cluj op een phaeoziom met een leemachtige textuur bodem12. Het roodzwenkgrasexperiment maakt deel uit van een grotere experimentele site die in 2001 is opgericht in Ghețari, Apuseni Mountains (46°49’064″ lat. N. N en 22°81’418” lang. E), op een preluvosol (terra rossa) bodemsoort13,14. Maïs werd verzameld in vijf verschillende groeifenofas12: B1 = 2-4 bladeren (als controlepunt voor het begin van mycorrhiza-kolonisatie); B2 = 6 bladeren; B3 = 8-10 bladeren; B4 = cob-vorming; B5 = fysiologische volwassenheid. Vanaf het 2-4 bladeren stadium (A0) werd een organische behandeling toegepast, wat resulteerde in een tweegradefactor (A1 = controle en A2 = behandeld). Wortels van rood zwenkgras werden verzameld bij de bloei van een experiment met vijf langdurige bevruchtingen13,14: V1 = controle, niet-bevrucht; V2 = 10 t·ha-1 mest; V3 = 10 t·ha-1 mest + N 50 kg·ha-1, P2O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P2O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 mest + N 100 kg·ha-1, P2O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. In elke ontwikkelingsfase werden uit elke bemestingsvariant vijf planten verzameld. De kleuringsprotocollen en hun prestaties in termen van monsterverwerkingstijd en kwaliteit van de kleuring werden geanalyseerd. De relatie tussen de ontwikkeling van AM-schimmeldraden en de aanwezigheid van zijn structuren in wortels werd voor elke soort afzonderlijk geanalyseerd en voortgezet met de identificatie van de meest tolerante wortels voor kolonisatie. De specifieke kolonisatiepatronen van elk wortelstelsel werden geanalyseerd op basis van kolonisatiekaarten en de waarde van AM-parameters.
Maïs is een eenjarige plant, wat een continue groei van de wortels impliceert, en dat was de belangrijkste reden om de MycoPatt in de groeifasen toe te passen. Rood zwenkgras is een overblijvende plant uit een grasland dat lange tijd is behandeld met verschillende meststoffen. De wortels hebben een kortere ontwikkeling van 1 jaar en de anthese wordt beschouwd als het vegetatiepunt wanneer de plant zijn metabolisme verandert van vegetatief naar generatief. Om deze planten tijdens deze intense activiteitsperiodes te vangen, werden de bovengenoemde tijdstippen gekozen. Bemonstering tijdens de vegetatieperiode is moeilijk voor deze soort wanneer deze in natuurlijke graslanden wordt gekweekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies over mycorrhiza kolonisatie zijn van vitaal belang voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën op agronomisch gebied. Het potentieel van meerdere gecultiveerde planten om een symbiotische associatie te vormen met arbusculaire mycorrhiza’s maakte ze een belangrijk onderdeel van de duurzame ontwikkeling van het agro-ecosysteem en het behoud van zijn gezondheid 16,17,18,19,20.<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit artikel maakt gebruik van gegevens die voortvloeien uit twee Ph.D. studies in het thematische gebied van “Corn Mycorrhizal Patterns Driven by Agronomic Inputs”, uitgevoerd door Victoria Pop-Moldovan, en “Mycorrhiza Status and Development of Colonization in Mountain Grassland Dominant Species”, uitgevoerd door Larisa Corcoz, onder de coördinatie van Prof. Dr. Roxana Vidican.
Materials
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26×76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
References
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).
- Jeffries, P., Barea, J. M., Hock, B. 4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems. The Mycota. IX Fungal Associations. , 51-75 (2012).
- Parniske, M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature Reviews Microbiology. 6 (10), 763-775 (2008).
- Gianinazzi, S., et al. Agroecology: The key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
- Lee, E. -. H., Eo, J. -. K., Ka, K. -. H., Eom, A. -. H. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and their roles in ecosystems. Mycobiology. 41 (3), 121-125 (2013).
- Zhang, Y., Zeng, M., Xiong, B., Yang, X. Ecological significance of arbuscular mycorrhiza biotechnology in modern agricultural system. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao = The Journal of Applied Ecology. 14 (4), 613-617 (2003).
- Shah, A. A., et al. Effect of endophytic Bacillus megaterium colonization on structure strengthening, microbial community, chemical composition and stabilization properties of Hybrid Pennisetum. Journal of the Science of Food and Agriculture. 100 (3), 1164-1173 (2020).
- Souza, T. . Handbook of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , (2015).
- Sun, X. -. G., Tang, M. Comparison of four routinely used methods for assessing root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi. Botany. 90 (11), 1073-1083 (2012).
- Smith, S., Read, D., Smith, S. E., Read, D. J. Colonization of Roots and Anatomy of Arbuscular Mycorrhiza. Mycorrhizal Symbiosis. , 42-90 (2008).
- Stoian, V., et al. Sensitive approach and future perspectives in microscopic patterns of mycorrhizal roots. Scientific Reports. 9 (1), 10233 (2019).
- Pop-Moldovan, V., et al. Divergence in corn mycorrhizal colonization patterns due to organic treatment. Plants. 10 (12), 2760 (2021).
- Corcoz, L., et al. Mycorrhizal patterns in the roots of dominant Festuca rubra in a high-natural-value grassland. Plants. 11 (1), 112 (2021).
- Corcoz, L., et al. Deciphering the colonization strategies in roots of long-term fertilized Festuca rubra. Agronomy. 12 (3), 650 (2022).
- Stoian, V., Florian, V. Mycorrhiza – Benefits, influence, diagnostic method. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Agriculture. 66 (1), 2009 (2009).
- Prates Júnior, P., et al. Agroecological coffee management increases arbuscular mycorrhizal fungi diversity. PLoS One. 14 (1), 0209093 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 222 (3), 1171-1175 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Towards an integrated mycorrhizal technology: Harnessing mycorrhiza for sustainable intensification in agriculture. Frontiers in Plant Science. 7, 1625 (2016).
- Bhale, U. N., Bansode, S. A., Singh, S., Gehlot, P., Singh, J. Multifactorial Role of Arbuscular Mycorrhizae in Agroecosystem. Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives. , 205-220 (2018).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
- Vaida, I., Păcurar, F., Rotar, I., Tomoș, L., Stoian, V. Changes in diversity due to long-term management in a high natural value grassland. Plants. 10 (4), 739 (2021).
- . The International Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi Available from: https://invam.wvu.edu/collection (2022)
- . The International Bank for the Glomeromycota Available from: https://www.i-beg.eu/ (2022)
