हेपेटिक ऊतक के 3 डी सेल संस्कृति मॉडल में हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का वैश्विक स्तर का परिमाणीकरण
Summary
यह प्रोटोकॉल रेखांकित करता है कि कैसे एक त्रि-आयामी सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग निकट-शारीरिक स्थिति में क्रोमैटिन संशोधनों को मॉडल, इलाज और विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
स्तनधारी कोशिकाओं की फ्लैट संस्कृतियां सेल फिजियोलॉजी को समझने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली इन विट्रो दृष्टिकोण हैं, लेकिन यह प्रणाली अप्राकृतिक रूप से तेजी से सेल प्रतिकृति के कारण ठोस ऊतकों को मॉडलिंग में सीमित है। परिपक्व क्रोमैटिन मॉडलिंग करते समय यह विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण होता है, क्योंकि तेजी से प्रतिकृति कोशिकाएं अक्सर डीएनए प्रतिकृति में शामिल होती हैं और एक विषम पॉलीप्लॉइड आबादी होती हैं। नीचे प्रस्तुत मॉडलिंग, उपचार, और एक तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर quiescent क्रोमैटिन संशोधनों का विश्लेषण करने के लिए एक वर्कफ़्लो है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइनों को एक इनक्यूबेटर में पुनरुत्पादक 3 डी गोलाकार के रूप में उगाया जाता है जो सक्रिय पोषक तत्व प्रसार और कम कर्तन बल प्रदान करता है। सोडियम ब्यूटिरेट और सोडियम सक्सिनेट के साथ उपचार ने क्रमशः हिस्टोन एसिटिलेशन और सक्सिनिलेशन में वृद्धि को प्रेरित किया। हिस्टोन एसिटिलेशन और सक्सिनिलेशन के स्तर में वृद्धि एक अधिक खुले क्रोमैटिन राज्य से जुड़ी हुई है। गोलाकार तब कोशिका नाभिक के अलगाव के लिए एकत्र किए जाते हैं, जिसमें से हिस्टोन प्रोटीन को उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के विश्लेषण के लिए निकाला जाता है। हिस्टोन विश्लेषण तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से किया जाता है जो अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ ऑनलाइन युग्मित होता है, इसके बाद एक इन-हाउस कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन होती है। अंत में, संयुक्त हिस्टोन चिह्नों की आवृत्ति और घटना की जांच करने के लिए डेटा प्रतिनिधित्व के उदाहरण दिखाए गए हैं।
Introduction
19वीं शताब्दी के उत्तरार्ध से, सेल संस्कृति प्रणालियों का उपयोग मानव शरीर के बाहर कोशिकाओं के विकास और विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया गयाहै 1,2। उनके उपयोग को यह अध्ययन करने के लिए भी बढ़ाया गया है कि ऊतक और अंग स्वस्थ और रोगग्रस्त दोनों संदर्भों में कैसे कार्य करते हैं 1,3। निलंबन कोशिकाएं (उदाहरण के लिए, रक्त कोशिकाएं) पेट्री डिश या फ्लास्क में मूल रूप से और परस्पर विकसित होती हैं क्योंकि वे विवो में तीन आयामी (3 डी) संरचनाओं में इकट्ठा नहीं होती हैं। ठोस अंगों से प्राप्त कोशिकाएं या तो दो-आयामी (2 डी) या 3 डी संस्कृति प्रणालियों में बढ़ सकती हैं। 2 डी संस्कृति में, कोशिकाओं को एक मोनोलेयर में उगाया जाता है जो एक सपाट सतह 2,4 का पालन करता है। 2 डी सेल संस्कृति प्रणालियों को घातीय विकास और तेजी से दोहरीकरण समय की विशेषता है, आमतौर पर 24 घंटे से कुछ दिनोंतक 5। 3 डी सिस्टम में कोशिकाएं जटिल सेल-सेल इंटरैक्शन मॉडलिंग ऊतक-जैसे समूहों को अधिक बारीकी से बनाने के लिए बढ़ती हैं, और उन्हें एक गतिशील संतुलन तक पहुंचने की उनकी क्षमता की विशेषता होती है जहां उनका दोहरीकरण समय 1 महीने या उससे अधिक समय तक पहुंच सकताहै।
इस पेपर में प्रस्तुत एक अभिनव पद्धति है जो घूर्णन सेल संस्कृति प्रणालियों में 3 डी गोलाकार विकसित करने के लिए है जो कम गुरुत्वाकर्षण 6 का अनुकरण करतीहै। यह 1990 के दशक में नासा द्वारा पेश की गई एक सेल संस्कृति प्रणाली का एक सरलीकृत व्युत्पन्नहै। यह दृष्टिकोण कर्तन बलों को कम करता है, जो कताई फ्लास्क जैसे मौजूदा तरीकों में होता है, और गोलाकार पुनरुत्पादनक्षमता 6 को बढ़ाता है। इसके अलावा, घूर्णन बायोरिएक्टर सक्रिय पोषक तत्व प्रसार को बढ़ाता है, जो नेक्रोटिक गठन को कम करता है जो कि हैंगिंग ड्रॉप सेल संस्कृति जैसी प्रणालियों में होता है जहां मीडिया विनिमय अव्यावहारिक है। इस तरह, कोशिकाएं ज्यादातर अबाधित रूप से बढ़ती हैं, जिससे ऊतक में बढ़ने वाली कोशिकाओं से जुड़ी संरचनात्मक और शारीरिक विशेषताओं के गठन की अनुमति मिलती है। C3A हेपेटोसाइट्स (HepG2 / C3A) इस तरह से सुसंस्कृत न केवल ultrastructural ऑर्गेनेल था, बल्कि एटीपी, adenylate kinase, यूरिया, और कोलेस्ट्रॉल की मात्रा का उत्पादन भी विवो 1,2 में देखे गए स्तरों के बराबर था। इसके अलावा, 2 डी बनाम.3D सेल संस्कृति प्रणालियों में उगाई गई कोशिकाएं विभिन्न जीन अभिव्यक्ति पैटर्न 8 प्रदर्शित करतीहैं। 3 डी गोलाकार के रूप में उगाए गए सी 3 ए हेपेटोसाइट्स के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला है कि इन कोशिकाओं ने यकृत-विशिष्ट प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला व्यक्त की, साथ ही साथ जिगर समारोह8 को विनियमित करने वाले प्रमुख मार्गों में शामिल जीन भी। पूर्व प्रकाशनों ने 3 डीगोलाकार संस्कृतियों में गतिशील संतुलन पर 2 डी संस्कृति बनाम कोशिकाओं में तेजी से बढ़ती कोशिकाओं के प्रोटिओम के बीच अंतर का प्रदर्शन किया। इन अंतरों में सेलुलर चयापचय शामिल है, जो बदले में कोशिका 5 की संरचना, कार्य और शरीर विज्ञान को प्रभावित करताहै। 2 डी संस्कृति में उगाई गई कोशिकाओं का प्रोटिओम सेल प्रतिकृति में शामिल प्रोटीन में अधिक समृद्ध था, जबकि 3 डी गोलाकार का प्रोटिओम यकृत कार्यक्षमता5 में अधिक समृद्ध था।
3 डी गोलाकार के रूप में उगाई गई कोशिकाओं की धीमी प्रतिकृति दर अधिक सटीक रूप से क्रोमैटिन राज्य और संशोधनों (जैसे हिस्टोन क्लिपिंग9) से जुड़ी विशिष्ट घटनाओं को मॉडल करती है। हिस्टोन क्लिपिंग एक अपरिवर्तनीय हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) है जो हिस्टोन एन-टर्मिनल पूंछ के हिस्से के प्रोटियोलिटिक दरार का कारण बनता है। जबकि इसका जैविक कार्य अभी भी चर्चा के तहत है 10,11,12,13, यह स्पष्ट है कि प्राथमिक कोशिकाओं और यकृत ऊतकों में इसकी उपस्थिति हेपजी 2 / सी 3 ए कोशिकाओं द्वारा मॉडलिंग की जाती है जो गोलाकार के रूप में उगाई जाती हैं, लेकिन फ्लैट कोशिकाओं के रूप में नहीं। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि क्रोमैटिन राज्य और संशोधन डीएनए रीडआउट को विनियमित करते हैं जो ज्यादातर जीन तक पहुंच को संशोधित करके और इस प्रकार उनकी अभिव्यक्ति14 है। हिस्टोन पीटीएम या तो क्रोमैटिन राज्य को सीधे न्यूक्लियोसोम के शुद्ध चार्ज को प्रभावित करके प्रभावित करते हैं जहां हिस्टोन इकट्ठा किए जाते हैं, या अप्रत्यक्ष रूप से क्रोमैटिन लेखकों, पाठकों और इरेज़र14 की भर्ती करके। सैकड़ों हिस्टोन पीटीएम की पहचान15 तारीख तक की गई है, जो इस परिकल्पना को मजबूत करती है कि क्रोमैटिन डीएनए16 की व्याख्या करने के लिए सेल द्वारा उपयोग किए जाने वाले “हिस्टोन कोड” को होस्ट करता है। हालांकि, पीटीएमसंयोजनों के असंख्य की पहचान 15, और यह खोज कि हिस्टोन पीटीएम के संयोजनों में अक्सर अलगाव में मौजूद पीटीएम से अलग-अलग जैविक कार्य होते हैं (उदाहरण के लिए फिशल, एट अल.17), इस बात पर प्रकाश डाला गया है कि “हिस्टोन कोड” को डिक्रिप्ट करने के लिए अधिक काम की आवश्यकता है।
वर्तमान में, हिस्टोन पीटीएम विश्लेषण या तो एंटीबॉडी का उपयोग करने वाली तकनीकों पर आधारित है (उदाहरण के लिए, पश्चिमी धब्बे, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, या क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिसिपिटेशन अनुक्रमण [CHIP-seq]) या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के बाद। एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों में उच्च संवेदनशीलता होती है और हिस्टोन के निशान के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन अक्सर 18,19,20 के संयोजन में मौजूद दुर्लभ पीटीएम या पीटीएम का अध्ययन करने में सीमित होते हैं। एमएस उच्च-थ्रूपुट और निष्पक्ष पहचान और एकल और सह-मौजूदा प्रोटीन संशोधनों के परिमाणीकरण के लिए अधिक उपयुक्त है, विशेष रूप से हिस्टोन प्रोटीन 18,19,20 में। इन कारणों से, इस और कई अन्य प्रयोगशालाओं ने हिस्टोन पेप्टाइड्स (बॉटम-अप एमएस), बरकरार हिस्टोन पूंछ (मध्य-डाउन एमएस), और पूर्ण लंबाई हिस्टोन प्रोटीन (टॉप-डाउन एमएस) 21,22,23 के विश्लेषण के लिए एमएस पाइपलाइन को अनुकूलित किया है।
नीचे विस्तृत HepG2 / C3A गोलाकार बढ़ने के लिए एक वर्कफ़्लो है और उन्हें नैनो-तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से हिस्टोन पेप्टाइड विश्लेषण (नीचे-ऊपर एमएस) के लिए तैयार करना, अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एनएलसी-एमएस / एमएस ) के साथ ऑनलाइन युग्मित है। एक 2 डी सेल संस्कृति विकसित की गई थी और कोशिकाओं को काटा गया था और एक बायोरिएक्टर में स्थानांतरित कर दिया गया था जहां वे गोलाकार बनाना शुरू कर देंगे (चित्रा 1)। संस्कृति में 18 दिनों के बाद, गोलाकार को सोडियम ब्यूटिरेट या सोडियम सक्सिनेट के साथ इलाज किया गया था ताकि हिस्टोन एसिटिलेशन और सक्सिनिलेशन के सापेक्ष बहुतायत को बढ़ाया जा सके। विशेष रूप से, 3 डी संस्कृतियों को जीनोटॉक्सिक यौगिकों के साथ-साथ उनके फ्लैट संस्कृति समकक्षों के साथ इलाज किया जा सकता है; वास्तव में, हाल के प्रकाशनों पर प्रकाश डाला गया है कि 3 डी संस्कृति में कोशिकाओं की विष विज्ञान प्रतिक्रिया24,25 डी फ्लैट संस्कृति में उन लोगों की तुलना में प्राथमिक ऊतकों के समान है। तब कोशिकाओं को निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर एकत्र किया गया था और परमाणु अलगाव किया गया था। फिर, हिस्टोन को गार्सिया एट अल.26 द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रिप्सिन पाचन से पहले और बाद में प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड के साथ निकाला और व्युत्पन्न किया गया था। यह प्रक्रिया रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी (सी18) और एमएस के साथ पता लगाने के साथ ऑनलाइन अलगाव के लिए एक उपयुक्त आकार के पेप्टाइड्स उत्पन्न करती है। अंत में, हिस्टोन पेप्टाइड्स की पहचान की गई और मात्रा निर्धारित की गई, और उत्पन्न डेटा को अधिक पूर्ण जैविक व्याख्या के लिए कई तरीकों से दर्शाया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
हिस्टोन पीटीएम का विश्लेषण मूल रूप से विशिष्ट प्रोटिओमिक्स विश्लेषण पाइपलाइन से अलग है। अधिकांश हिस्टोन पीटीएम में अभी भी रहस्यमय जैविक कार्य हैं; नतीजतन, जीन ओंटोलॉजी या पाथवे डेटाबेस जैसे एनोटेशन …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सिडोली प्रयोगशाला कृतज्ञतापूर्वक ल्यूकेमिया रिसर्च फाउंडेशन (Hollis Brownstein नए अन्वेषक अनुसंधान अनुदान), AFAR (Sagol नेटवर्क GerOmics पुरस्कार), Deerfield (Xseed पुरस्कार), रिले Therapeutics, मर्क, और निदेशक के एनआईएच कार्यालय (1S10OD030286-01) को स्वीकार करती है।
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
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