Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein dreidimensionales Zellkultursystem verwendet werden kann, um Chromatinmodifikationen in einem nahezu physiologischen Zustand zu modellieren, zu behandeln und zu analysieren.

Abstract

Flachkulturen von Säugetierzellen sind ein weit verbreiteter In-vitro-Ansatz zum Verständnis der Zellphysiologie, aber dieses System ist bei der Modellierung von festem Gewebe aufgrund der unnatürlich schnellen Zellreplikation begrenzt. Dies ist besonders schwierig bei der Modellierung von reifem Chromatin, da schnell replizierende Zellen häufig an der DNA-Replikation beteiligt sind und eine heterogene polyploide Population aufweisen. Im Folgenden finden Sie einen Workflow zum Modellieren, Behandeln und Analysieren von ruhenden Chromatinmodifikationen mit einem dreidimensionalen (3D) Zellkultursystem. Unter Verwendung dieses Protokolls werden hepatozelluläre Karzinomzelllinien als reproduzierbare 3D-Sphäroide in einem Inkubator gezüchtet, die eine aktive Nährstoffdiffusion und geringe Scherkräfte bieten. Die Behandlung mit Natriumbutyrat und Natriumsuccinat induzierte eine Zunahme der Histonacetylierung bzw. der Succinylierung. Erhöhungen der Histonacetylierung und Succinylierung sind mit einem offeneren Chromatinzustand verbunden. Sphäroide werden dann zur Isolierung von Zellkernen gesammelt, aus denen Histonproteine für die Analyse ihrer posttranslationalen Modifikationen extrahiert werden. Die Histonanalyse wird über die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt, gefolgt von einer internen Rechenpipeline. Abschließend werden Beispiele für die Datendarstellung zur Untersuchung der Häufigkeit und des Auftretens kombinatorischer Histonspuren gezeigt.

Introduction

Seit dem späten 19. Jahrhundert werden Zellkultursysteme als Modell verwendet, um das Wachstum und die Entwicklung von Zellen außerhalb des menschlichen Körpers zu untersuchen ^1,2. Ihre Verwendung wurde auch erweitert, um zu untersuchen, wie Gewebe und Organe sowohl in gesunden als auch in kranken Kontexten funktionieren ^1,3. Suspensionszellen (z.B. Blutzellen) wachsen in Petrischalen oder Kolben nahtlos und austauschbar, da sie sich nicht in vivo in dreidimensionalen (3D) Strukturen zusammensetzen. Zellen, die aus festen Organen gewonnen werden, können entweder in zweidimensionalen (2D) oder 3D-Kultursystemen wachsen. In der 2D-Kultur werden Zellen in einer Monoschicht gezüchtet, die an einer flachen Oberfläche^{haftet 2,4}. 2D-Zellkultursysteme zeichnen sich durch exponentielles Wachstum und eine schnelle Verdopplungszeit aus, typischerweise 24 h bis zu einigen Tagen⁵. Zellen in 3D-Systemen wachsen zu komplizierten Zell-Zell-Interaktionen, die gewebeähnliche Konglomerate genauer modellieren, und sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, ein dynamisches Gleichgewicht zu erreichen, in dem ihre Verdopplungszeit 1 Monat oder länger erreichen kann⁵.

In diesem Artikel wird eine innovative Methodik zur Züchtung von 3D-Sphäroiden in rotierenden Zellkultursystemen vorgestellt, die eine reduzierte Schwerkraft simulieren⁶. Dies ist ein vereinfachtes Derivat eines Zellkultursystems, das von der NASA in den 1990er Jahren eingeführt^{wurde 7}. Dieser Ansatz minimiert die Scherkräfte, die bei bestehenden Methoden wie Spinnkolben auftreten, und erhöht die Sphäroidreproduzierbarkeit⁶. Darüber hinaus erhöht der rotierende Bioreaktor die aktive Nährstoffdiffusion und minimiert die nekrotische Bildung, die in Systemen wie der hängenden Tropfenzellkultur auftritt, in der der Medienaustausch unpraktisch ist⁶. Auf diese Weise wachsen die Zellen weitgehend ungestört, was die Bildung struktureller und physiologischer Eigenschaften ermöglicht, die mit dem Wachstum von Zellen im Gewebe verbunden sind. Auf diese Weise kultivierte C3A-Hepatozyten (HepG2/C3A) hatten nicht nur ultrastrukturelle Organellen, sondern produzierten auch Mengen an ATP, Adenylatkinase, Harnstoff und Cholesterin, die mit den in vivo ^1,2 beobachteten Spiegeln vergleichbar waren. Darüber hinaus weisen Zellen, die in 2D.3D im Vergleich zu Zellkultursystemen gezüchtet wurden, unterschiedliche Genexpressionsmuster^{auf 8}. Die Genexpressionsanalyse von C3A-Hepatozyten, die als 3D-Sphäroide gezüchtet wurden, zeigte, dass diese Zellen eine breite Palette von leberspezifischen Proteinen sowie Gene exprimierten, die an Schlüsselwegen beteiligt sind, die die Leberfunktion regulieren⁸. Frühere Veröffentlichungen zeigten die Unterschiede zwischen Proteomen exponentiell wachsender Zellen in 2D-Kultur und Zellen im dynamischen Gleichgewicht in 3D-Sphäroidekulturen⁵. Zu diesen Unterschieden gehört der Zellstoffwechsel, der wiederum die Struktur, Funktion und Physiologie der Zelle beeinflusst⁵. Das Proteom von Zellen, die in 2D-Kultur gezüchtet wurden, war stärker mit Proteinen angereichert, die an der Zellreplikation beteiligt waren, während das Proteom von 3D-Sphäroiden in der Leberfunktionalität^{angereichert war 5}.

Die langsamere Replikationsrate von Zellen, die als 3D-Sphäroide gezüchtet werden, modelliert genauer spezifische Phänomene, die mit dem Chromatinzustand und Modifikationen verbunden sind (z. B. Histon-Clipping⁹). Histon-Clipping ist eine irreversible Histon-posttranslationale Modifikation (PTM), die eine proteolytische Spaltung eines Teils des Histon-N-terminalen Schweifs verursacht. Während seine biologische Funktion noch diskutiert wird^10,11,12,13, ist es klar, dass seine Anwesenheit in Primärzellen und Lebergewebe von HepG2 / C3A-Zellen modelliert wird, die als Sphäroide gezüchtet wurden^, aber nicht als flache Zellen⁹. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da der Chromatinzustand und die Modifikationen die DNA-Auslesung hauptsächlich durch Modulation der Zugänglichkeit zu Genen und damit ihrer Expression^{regulieren 14}. Histon-PTMs beeinflussen entweder den Chromatinzustand direkt, indem sie die Nettoladung der Nukleosomen beeinflussen, in denen Histone zusammengesetzt sind, oder indirekt durch die Rekrutierung von Chromatin-Schreibern, Lesern und Radiergummis¹⁴. Hunderte von Histon-PTMs wurden bis heute¹⁵ identifiziert, was die Hypothese verstärkt, dass Chromatin einen “Histon-Code” beherbergt, der von der Zelle zur Interpretation von DNA¹⁶ verwendet wird. Die Identifizierung einer Vielzahl von PTM-Kombinationen¹⁵ und die Entdeckung, dass Kombinationen von Histon-PTMs häufig andere biologische Funktionen haben als PTMs, die isoliert vorliegen (z. B. Fischle, et ^al.17), zeigen jedoch, dass mehr Arbeit erforderlich ist, um den “Histoncode” zu entschlüsseln.

Derzeit basiert die Histon-PTM-Analyse entweder auf Techniken, die Antikörper verwenden (z. B. westliche Flecken, Immunfluoreszenz oder Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung [ChIP-seq]) oder Massenspektrometrie (MS). Antikörper-basierte Techniken haben eine hohe Sensitivität und können detaillierte Informationen über die genomweite Lokalisierung von Histonmarkierungen liefern, sind jedoch häufig bei der Untersuchung seltener PTMs oder PTMs in Kombinationen^{begrenzt 18,19,20}. MS eignet sich besser für den Hochdurchsatz und die unvoreingenommene Identifizierung und Quantifizierung einzelner und koexistierender Proteinmodifikationen, insbesondere Histonproteine^18,19,20. Aus diesen Gründen haben dieses und mehrere andere Labore die MS-Pipeline für die Analyse von Histonpeptiden (Bottom-up-MS), intakten Histonschwänzen (Middle-Down-MS) und Histonproteinen in voller Länge (Top-Down-MS) ^{optimiert21,22,23}.

Im Folgenden finden Sie einen Workflow für die Züchtung von HepG2/C3A-Sphäroiden und deren Vorbereitung für die Histonpeptidanalyse (Bottom-up-MS) mittels Nano-Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (nLC-MS/MS). Eine 2D-Zellkultur wurde gezüchtet und die Zellen wurden geerntet und in einen Bioreaktor gebracht, wo sie Sphäroide bilden würden (Abbildung 1). Nach 18 Tagen in Kultur wurden Sphäroide mit Natriumbutyrat oder Natriumsuccinat behandelt, um die relative Häufigkeit von Histonacetylierung und Succinylierung zu erhöhen. Insbesondere können 3D-Kulturen mit genotoxischen Verbindungen genauso gut behandelt werden wie ihre flachen Kulturäquivalente; Tatsächlich heben neuere Veröffentlichungen hervor, dass die toxikologische Reaktion von Zellen in 3D-Kultur dem Primärgewebe ähnlicher ist als die in 2D-Flachkultur^24,25. Zellen wurden dann zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt und eine nukleare Isolierung durchgeführt. Dann wurden Histone extrahiert und mit Propionanhydrid vor und nach der Trypsinverdauung nach einem Protokoll abgeleitet, das zuerst von Garcia et ^al.26 entwickelt wurde. Dieses Verfahren erzeugt Peptide in geeigneter Größe für die Online-Trennung mit Umkehrphasenchromatographie (C₁₈) und den Nachweis mit MS. Schließlich wurden Histonpeptide identifiziert und quantifiziert, und die generierten Daten wurden auf vielfältige Weise für eine vollständigere biologische Interpretation dargestellt.

Protocol

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien Zellwachstumsmedien (für HepG2/C3A-Zellen): Fügen Sie fötales Rinderserum (FBS) (10% v/v), nicht-essentielle Aminosäuren (1% v/v), L-Glutamin-Ergänzung (1% v/v) und Penicillin/Streptomycin (0,5% v/v) zu Dulbeccos Modified Eagle’s Medium (DMEM, mit 4,5 g/L Glukose) hinzu. Wachstumsmedien werden bei 4 °C für maximal 2 Wochen gelagert. 200 mM Natriumbutyrat (NaBut)-Lösung: Zur Herstellung von 10 ml werden 220,18 mg NaBut in 10 ml ddH…

Representative Results

In diesem Protokoll wurden HepG2/C3A-Sphäroide mit 20 mM NaBut und 10 mM NaSuc behandelt, die beide die globalen Konzentrationen von Histon-PTMs beeinflussten (Abbildung 3A). Histon-PTMs wurden dann identifiziert und auf Einzelrückstandsebene mittels MS/MS-Erfassung quantifiziert (Abbildung 3B). Wenn Stichproben in Replikaten ausgeführt werden, kann eine statistische Analyse durchgeführt werden, um die Anreicherung der Fa…

Discussion

Die Analyse von Histon-PTMs unterscheidet sich grundlegend von der typischen Proteomik-Analysepipeline. Die meisten Histon-PTMs haben immer noch rätselhafte biologische Funktionen; Infolgedessen sind Annotationen wie Gene Ontology oder Pathway-Datenbanken nicht verfügbar. Es gibt mehrere Ressourcen, die Histonmodifikationen mit dem Enzym assoziieren, das für ihre Katalyse verantwortlich ist, oder mit Proteinen, die Domänen enthalten, die diese PTMs binden (z. B. HISTome³⁶). Es ist auch möglic…

Materials

0.05% trypsin-EDTA solution	Gibco	25300054
0.5-20 µL pipet tips	BRAND	13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubes	Bio-Rad	2239480
10 µL multi-channel pipette	BRAND	BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringe	Henke Sass Wolf	14-817-31 (Fisher Scientific)	Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes	Eppendorf	14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tips	Rainin	30389164
18 G syringe needle	Air-Tite	14-817-100 (Fisher Scientific)	3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipette	Corning	4082
2-200 µL pipet tips	BRAND	Z740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplate	Corning	07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flask	Corning	461464U	Untreated, with vent cap
96-well skirted plate	Axygen	PCR-96-FS-C (Corning)
Acetone	Fisher Scientific	A949-1	Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	A6141-25G
Ammonium hydroxide solution	Fisher Scientific	AC423300250
Cell culture grade water	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar	CelVivo	N/A	Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unit	CelVivo	N/A	Tablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	17-205-CV	1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV
Formic acid	Thermo Scientific	28905
Fume hood	Mott	N/A	Model 7121000
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-8B	9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplement	Corning	25-015-CI	200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W6-1
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific	A481-212
Ice	N/A	N/A
MEM non-essential amino acids	Corning	25-025-CI	100X solution
Oasis HLB resin	Waters	186007549	Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	High resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plate	Orochem	OF1100	96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI	100X solution
pH paper	Hydrion	Z111848 (Sigma-Aldrich)	0-13 pH test paper
Pipette gun	Eppendorf	Z666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillary	Molex	50-110-7740 (Fisher Scientific)	Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile	Fisher Scientific	1367549
Propionic anhydride	Sigma-Aldrich	240311-50G
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420
Reprosil-Pur resin	MSWIL	R13.AQ.0003	120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
Rotator	Clay Adams	25477 (American Laboratory Trading)	Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sodium butyrate	Thermo Scientific	A11079
Sodium succinate dibasic	Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)	Savant	20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well)	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
Sterile hood	Thermo Scientific	1375	Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4)	Fisher Scientific	02-004-375	Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish	Fisher Scientific	08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA)	Thermo Scientific	AC421451000	Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA)	Fisher Scientific	PI28904	Sequencing grade
Vacuum manifold 96-well	Millipore	MAVM0960R
Vortex	Sigma-Aldrich	Z258415
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µL	Axygen	14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µL	Axygen	14-222-730 (Fisher Scientific)