Dieses Protokoll beschreibt, wie ein dreidimensionales Zellkultursystem verwendet werden kann, um Chromatinmodifikationen in einem nahezu physiologischen Zustand zu modellieren, zu behandeln und zu analysieren.
Flachkulturen von Säugetierzellen sind ein weit verbreiteter In-vitro-Ansatz zum Verständnis der Zellphysiologie, aber dieses System ist bei der Modellierung von festem Gewebe aufgrund der unnatürlich schnellen Zellreplikation begrenzt. Dies ist besonders schwierig bei der Modellierung von reifem Chromatin, da schnell replizierende Zellen häufig an der DNA-Replikation beteiligt sind und eine heterogene polyploide Population aufweisen. Im Folgenden finden Sie einen Workflow zum Modellieren, Behandeln und Analysieren von ruhenden Chromatinmodifikationen mit einem dreidimensionalen (3D) Zellkultursystem. Unter Verwendung dieses Protokolls werden hepatozelluläre Karzinomzelllinien als reproduzierbare 3D-Sphäroide in einem Inkubator gezüchtet, die eine aktive Nährstoffdiffusion und geringe Scherkräfte bieten. Die Behandlung mit Natriumbutyrat und Natriumsuccinat induzierte eine Zunahme der Histonacetylierung bzw. der Succinylierung. Erhöhungen der Histonacetylierung und Succinylierung sind mit einem offeneren Chromatinzustand verbunden. Sphäroide werden dann zur Isolierung von Zellkernen gesammelt, aus denen Histonproteine für die Analyse ihrer posttranslationalen Modifikationen extrahiert werden. Die Histonanalyse wird über die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt, gefolgt von einer internen Rechenpipeline. Abschließend werden Beispiele für die Datendarstellung zur Untersuchung der Häufigkeit und des Auftretens kombinatorischer Histonspuren gezeigt.
Seit dem späten 19. Jahrhundert werden Zellkultursysteme als Modell verwendet, um das Wachstum und die Entwicklung von Zellen außerhalb des menschlichen Körpers zu untersuchen 1,2. Ihre Verwendung wurde auch erweitert, um zu untersuchen, wie Gewebe und Organe sowohl in gesunden als auch in kranken Kontexten funktionieren 1,3. Suspensionszellen (z.B. Blutzellen) wachsen in Petrischalen oder Kolben nahtlos und austauschbar, da sie sich nicht in vivo in dreidimensionalen (3D) Strukturen zusammensetzen. Zellen, die aus festen Organen gewonnen werden, können entweder in zweidimensionalen (2D) oder 3D-Kultursystemen wachsen. In der 2D-Kultur werden Zellen in einer Monoschicht gezüchtet, die an einer flachen Oberflächehaftet 2,4. 2D-Zellkultursysteme zeichnen sich durch exponentielles Wachstum und eine schnelle Verdopplungszeit aus, typischerweise 24 h bis zu einigen Tagen5. Zellen in 3D-Systemen wachsen zu komplizierten Zell-Zell-Interaktionen, die gewebeähnliche Konglomerate genauer modellieren, und sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, ein dynamisches Gleichgewicht zu erreichen, in dem ihre Verdopplungszeit 1 Monat oder länger erreichen kann5.
In diesem Artikel wird eine innovative Methodik zur Züchtung von 3D-Sphäroiden in rotierenden Zellkultursystemen vorgestellt, die eine reduzierte Schwerkraft simulieren6. Dies ist ein vereinfachtes Derivat eines Zellkultursystems, das von der NASA in den 1990er Jahren eingeführtwurde 7. Dieser Ansatz minimiert die Scherkräfte, die bei bestehenden Methoden wie Spinnkolben auftreten, und erhöht die Sphäroidreproduzierbarkeit6. Darüber hinaus erhöht der rotierende Bioreaktor die aktive Nährstoffdiffusion und minimiert die nekrotische Bildung, die in Systemen wie der hängenden Tropfenzellkultur auftritt, in der der Medienaustausch unpraktisch ist6. Auf diese Weise wachsen die Zellen weitgehend ungestört, was die Bildung struktureller und physiologischer Eigenschaften ermöglicht, die mit dem Wachstum von Zellen im Gewebe verbunden sind. Auf diese Weise kultivierte C3A-Hepatozyten (HepG2/C3A) hatten nicht nur ultrastrukturelle Organellen, sondern produzierten auch Mengen an ATP, Adenylatkinase, Harnstoff und Cholesterin, die mit den in vivo 1,2 beobachteten Spiegeln vergleichbar waren. Darüber hinaus weisen Zellen, die in 2D.3D im Vergleich zu Zellkultursystemen gezüchtet wurden, unterschiedliche Genexpressionsmusterauf 8. Die Genexpressionsanalyse von C3A-Hepatozyten, die als 3D-Sphäroide gezüchtet wurden, zeigte, dass diese Zellen eine breite Palette von leberspezifischen Proteinen sowie Gene exprimierten, die an Schlüsselwegen beteiligt sind, die die Leberfunktion regulieren8. Frühere Veröffentlichungen zeigten die Unterschiede zwischen Proteomen exponentiell wachsender Zellen in 2D-Kultur und Zellen im dynamischen Gleichgewicht in 3D-Sphäroidekulturen5. Zu diesen Unterschieden gehört der Zellstoffwechsel, der wiederum die Struktur, Funktion und Physiologie der Zelle beeinflusst5. Das Proteom von Zellen, die in 2D-Kultur gezüchtet wurden, war stärker mit Proteinen angereichert, die an der Zellreplikation beteiligt waren, während das Proteom von 3D-Sphäroiden in der Leberfunktionalitätangereichert war 5.
Die langsamere Replikationsrate von Zellen, die als 3D-Sphäroide gezüchtet werden, modelliert genauer spezifische Phänomene, die mit dem Chromatinzustand und Modifikationen verbunden sind (z. B. Histon-Clipping9). Histon-Clipping ist eine irreversible Histon-posttranslationale Modifikation (PTM), die eine proteolytische Spaltung eines Teils des Histon-N-terminalen Schweifs verursacht. Während seine biologische Funktion noch diskutiert wird10,11,12,13, ist es klar, dass seine Anwesenheit in Primärzellen und Lebergewebe von HepG2 / C3A-Zellen modelliert wird, die als Sphäroide gezüchtet wurden, aber nicht als flache Zellen9. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da der Chromatinzustand und die Modifikationen die DNA-Auslesung hauptsächlich durch Modulation der Zugänglichkeit zu Genen und damit ihrer Expressionregulieren 14. Histon-PTMs beeinflussen entweder den Chromatinzustand direkt, indem sie die Nettoladung der Nukleosomen beeinflussen, in denen Histone zusammengesetzt sind, oder indirekt durch die Rekrutierung von Chromatin-Schreibern, Lesern und Radiergummis14. Hunderte von Histon-PTMs wurden bis heute15 identifiziert, was die Hypothese verstärkt, dass Chromatin einen “Histon-Code” beherbergt, der von der Zelle zur Interpretation von DNA16 verwendet wird. Die Identifizierung einer Vielzahl von PTM-Kombinationen15 und die Entdeckung, dass Kombinationen von Histon-PTMs häufig andere biologische Funktionen haben als PTMs, die isoliert vorliegen (z. B. Fischle, et al.17), zeigen jedoch, dass mehr Arbeit erforderlich ist, um den “Histoncode” zu entschlüsseln.
Derzeit basiert die Histon-PTM-Analyse entweder auf Techniken, die Antikörper verwenden (z. B. westliche Flecken, Immunfluoreszenz oder Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung [ChIP-seq]) oder Massenspektrometrie (MS). Antikörper-basierte Techniken haben eine hohe Sensitivität und können detaillierte Informationen über die genomweite Lokalisierung von Histonmarkierungen liefern, sind jedoch häufig bei der Untersuchung seltener PTMs oder PTMs in Kombinationenbegrenzt 18,19,20. MS eignet sich besser für den Hochdurchsatz und die unvoreingenommene Identifizierung und Quantifizierung einzelner und koexistierender Proteinmodifikationen, insbesondere Histonproteine18,19,20. Aus diesen Gründen haben dieses und mehrere andere Labore die MS-Pipeline für die Analyse von Histonpeptiden (Bottom-up-MS), intakten Histonschwänzen (Middle-Down-MS) und Histonproteinen in voller Länge (Top-Down-MS) optimiert21,22,23.
Im Folgenden finden Sie einen Workflow für die Züchtung von HepG2/C3A-Sphäroiden und deren Vorbereitung für die Histonpeptidanalyse (Bottom-up-MS) mittels Nano-Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (nLC-MS/MS). Eine 2D-Zellkultur wurde gezüchtet und die Zellen wurden geerntet und in einen Bioreaktor gebracht, wo sie Sphäroide bilden würden (Abbildung 1). Nach 18 Tagen in Kultur wurden Sphäroide mit Natriumbutyrat oder Natriumsuccinat behandelt, um die relative Häufigkeit von Histonacetylierung und Succinylierung zu erhöhen. Insbesondere können 3D-Kulturen mit genotoxischen Verbindungen genauso gut behandelt werden wie ihre flachen Kulturäquivalente; Tatsächlich heben neuere Veröffentlichungen hervor, dass die toxikologische Reaktion von Zellen in 3D-Kultur dem Primärgewebe ähnlicher ist als die in 2D-Flachkultur24,25. Zellen wurden dann zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt und eine nukleare Isolierung durchgeführt. Dann wurden Histone extrahiert und mit Propionanhydrid vor und nach der Trypsinverdauung nach einem Protokoll abgeleitet, das zuerst von Garcia et al.26 entwickelt wurde. Dieses Verfahren erzeugt Peptide in geeigneter Größe für die Online-Trennung mit Umkehrphasenchromatographie (C18) und den Nachweis mit MS. Schließlich wurden Histonpeptide identifiziert und quantifiziert, und die generierten Daten wurden auf vielfältige Weise für eine vollständigere biologische Interpretation dargestellt.
Die Analyse von Histon-PTMs unterscheidet sich grundlegend von der typischen Proteomik-Analysepipeline. Die meisten Histon-PTMs haben immer noch rätselhafte biologische Funktionen; Infolgedessen sind Annotationen wie Gene Ontology oder Pathway-Datenbanken nicht verfügbar. Es gibt mehrere Ressourcen, die Histonmodifikationen mit dem Enzym assoziieren, das für ihre Katalyse verantwortlich ist, oder mit Proteinen, die Domänen enthalten, die diese PTMs binden (z. B. HISTome36). Es ist auch möglic…
The authors have nothing to disclose.
Das Sidoli-Labor dankt der Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck und dem NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
Ice | N/A | N/A | |
MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |