Ce protocole décrit comment un système de culture cellulaire tridimensionnel peut être utilisé pour modéliser, traiter et analyser les modifications de la chromatine dans un état quasi physiologique.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Quantification au niveau global des modifications post-traductionnelles des histones dans un modèle de culture cellulaire 3D de tissu hépatique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cultures plates de cellules de mammifères sont une approche in vitro largement utilisée pour comprendre la physiologie cellulaire, mais ce système est limité dans la modélisation des tissus solides en raison de la réplication cellulaire anormalement rapide. Ceci est particulièrement difficile lors de la modélisation de la chromatine mature, car les cellules à réplication rapide sont fréquemment impliquées dans la réplication de l’ADN et ont une population polyploïde hétérogène. Vous trouverez ci-dessous un flux de travail pour la modélisation, le traitement et l’analyse des modifications de la chromatine au repos à l’aide d’un système de culture cellulaire tridimensionnelle (3D). En utilisant ce protocole, les lignées cellulaires de carcinome hépatocellulaire sont cultivées sous forme de sphéroïdes 3D reproductibles dans un incubateur fournissant une diffusion active des nutriments et de faibles forces de cisaillement. Le traitement au butyrate de sodium et au succinate de sodium a induit une augmentation de l’acétylation des histones et de la succinylation, respectivement. Les augmentations des niveaux d’acétylation des histones et de succinylation sont associées à un état de chromatine plus ouvert. Les sphéroïdes sont ensuite collectés pour isoler les noyaux cellulaires, à partir desquels les protéines d’histones sont extraites pour l’analyse de leurs modifications post-traductionnelles. L’analyse des histones est réalisée par chromatographie liquide couplée en ligne à la spectrométrie de masse en tandem, suivie d’un pipeline de calcul interne. Enfin, des exemples de représentation de données pour étudier la fréquence et l’occurrence des marques combinatoires d’histones sont montrés.
Introduction
Depuis la fin du19e siècle, les systèmes de culture cellulaire ont été utilisés comme modèle pour étudier la croissance et le développement des cellules en dehors du corps humain 1,2. Leur utilisation a également été étendue pour étudier le fonctionnement des tissus et des organes dans des contextes sains et malades 1,3. Les cellules en suspension (p. ex. les cellules sanguines) se développent dans des boîtes de Pétri ou des flacons de façon transparente et interchangeable, car elles ne s’assemblent pas dans des structures tridimensionnelles....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Préparation des tampons et des réactifs
- Milieux de croissance cellulaire (pour les cellules HepG2/C3A) : Ajouter le sérum fœtal bovin (FBS) (10 % v/v), les acides aminés non essentiels (1 % v/v), le supplément de L-glutamine (1 % v/v) et la pénicilline/streptomycine (0,5 % v/v) au milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM, contenant 4,5 g/L de glucose). Les milieux de croissance sont conservés à 4 °C pendant un maximum de 2 semaines.
- Solution de butyrate de sodium (NaBut) de 200 mM : Pour préparer 10 mL, remettre en suspension 220,18 mg de NaBut dans 10 mL de ddH2O. Conserver 1 mL d’aliquotes à -20 °C. Avant le traite....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Dans ce protocole, les sphéroïdes HepG2/C3A ont été traités avec 20 mM de NaBut et 10 mM de NaSuc, qui ont tous deux affecté les niveaux globaux d’histones PTM (Figure 3A). Les PTM d’histones ont ensuite été identifiés et quantifiés au niveau de résidu unique par acquisition de MS/MS (Figure 3B).
Lorsque les échantillons sont exécutés en répétitions, une analyse statistique peut être effectuée pour évaluer l’enrichissement du.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
L’analyse des PTM d’histones est fondamentalement différente du pipeline d’analyse protéomique typique. La plupart des PTM d’histones ont encore des fonctions biologiques énigmatiques; par conséquent, les annotations telles que l’ontologie des gènes ou les bases de données de voies ne sont pas disponibles. Il existe plusieurs ressources qui associent les modifications des histones à l’enzyme responsable de leur catalyse ou aux protéines contenant des domaines qui lient ces PTM (par exemple, HISTome36
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Le laboratoire Sidoli remercie la Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), l’AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck et le NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,05 % trypsine-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0,5-20 & micro ; Pointes de pipette L | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| Tubes à centrifuger de 1,5 mL | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 & micro ; Pipette multicanaux L | BRAND BR7059000 (Millipore Sigma) | ||
| Seringue de 10 mL | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Pointe Luer lock, graduée à 12 mL |
| 10, 20, 200 et 1000 & micro ; L pipettes monocanaux | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 & micro ; Pointes de pipette | L Rainin | 30389164 | |
| 18 G aiguille de seringue | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3 » longueur, 0,05 » diamètre |
| 200 µ ; L pipette multicanaux | Corning | 4082 | |
| 2-200 & micro ; Pointes de pipette | L BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| Microplaque à fixation ultra-basse 24 puits | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 ; Fiole de culture cellulaire en forme de U | Corning | 461464U | Non traitée, avec capuchon d’aération |
| Plaque à jupe à 96 puits | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acétone | Fisher Scientific | A949-1 | L’acétone doit être utilisée à froid |
| Bicarbonate d’ammonium (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Hydroxyde d’ammonium solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Eau de qualité culture cellulaire | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioréacteur pour la culture cellulaire 3D |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubateur pour culture cellulaire 3D |
| Unité de contrôle | CelVivo | N/A | Tablette pour ClinoStar |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution avec 4,5 g/L de glucose et de pyruvate de sodium, sans L-glutamine et rouge de phénol |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Acide formique | Thermo Scientific | 28905 | |
| Hotte | Mott | N/A | Modèle 7121000 |
| Verre Pipette Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", bouchée en coton, verre borosilicaté, |
| supplément Glutagro | non stérile Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS) | Corning | 21-022-CV | Solution 1X sans calcium, magnésium et rouge phénol |
| Acétonitrile de qualité HPLC | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Eau de qualité HPLC | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Acide chlorhydrique (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Glace | N/A | N/A | |
| MEM acides aminés non essentiels | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Résine Oasis HLB | Eaux | 186007549 | Résine hydrophile-lipophile-équilibrée (HLB) avec 30µ ; m taille des particules |
| Orbitrap Fusion Lumos Spectromètre de masse Tribrid | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | Spectromètre de masse haute résolution |
| Oro-Flex I plaque filtrante en polypropylène | Orochem | OF1100 | 96 puits avec 10 & micro ; M PE fritte |
| Pénicilline-Streptomycine | Corning | 30-002-CI | Solution 100X |
| Papier pH | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | Papier réactif pH 0-13 |
| Pistolet | pipette Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillaire | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Tube capillaire flexible en silice fondue avec revêtement en polymide, 75 µ ; M ID x 363 et micro ; M OD |
| Pipettes sérologiques en polystyrène 10 mL, stériles | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Anhydride propionique | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Centrifugeuse réfrigérée | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Résine Reprosil-Pur | MSWIL | R13. AQ.0003 | 120 & Aring ; taille des pores, phase C18-AQ, 3 & micro ; Taille de perle |
| M Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Trypsine modifiée de qualité séquençage | Promega | V5111 | |
| Butyrate de sodium | Thermo Scientific | A11079 | |
| Succinate de sodium dibasique | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| Concentrateur sous vide SpeedVac (tubes de microcentrifugation de 1,5 ml) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| Concentrateur sous vide SpeedVac (96 puits) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant |
| SPD1010 Hotte stérile | Thermo Scientific | 1375 | Classe II, Type A2 |
| Acide sulfurique (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker |
| Analyze ACS réactifBoîte de 100 mm x 20 mm traitée pour culture tissulaire | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Acide trichloracétique (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspension 100 % p/v dans de l’eau de qualité HPLC |
| Acide trifluoroacétique (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Qualité de séquençage |
| Collecteur sous vide 96 puits | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Bain-marie | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Pointes de pipette à large diamètre 1000 & micro ; L | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Pointes de pipette à large diamètre 200 & micro ; L | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
Références
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing lin....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
