Quantification au niveau global des modifications post-traductionnelles des histones dans un modèle de culture cellulaire 3D de tissu hépatique

Summary

Ce protocole décrit comment un système de culture cellulaire tridimensionnel peut être utilisé pour modéliser, traiter et analyser les modifications de la chromatine dans un état quasi physiologique.

Abstract

Les cultures plates de cellules de mammifères sont une approche in vitro largement utilisée pour comprendre la physiologie cellulaire, mais ce système est limité dans la modélisation des tissus solides en raison de la réplication cellulaire anormalement rapide. Ceci est particulièrement difficile lors de la modélisation de la chromatine mature, car les cellules à réplication rapide sont fréquemment impliquées dans la réplication de l’ADN et ont une population polyploïde hétérogène. Vous trouverez ci-dessous un flux de travail pour la modélisation, le traitement et l’analyse des modifications de la chromatine au repos à l’aide d’un système de culture cellulaire tridimensionnelle (3D). En utilisant ce protocole, les lignées cellulaires de carcinome hépatocellulaire sont cultivées sous forme de sphéroïdes 3D reproductibles dans un incubateur fournissant une diffusion active des nutriments et de faibles forces de cisaillement. Le traitement au butyrate de sodium et au succinate de sodium a induit une augmentation de l’acétylation des histones et de la succinylation, respectivement. Les augmentations des niveaux d’acétylation des histones et de succinylation sont associées à un état de chromatine plus ouvert. Les sphéroïdes sont ensuite collectés pour isoler les noyaux cellulaires, à partir desquels les protéines d’histones sont extraites pour l’analyse de leurs modifications post-traductionnelles. L’analyse des histones est réalisée par chromatographie liquide couplée en ligne à la spectrométrie de masse en tandem, suivie d’un pipeline de calcul interne. Enfin, des exemples de représentation de données pour étudier la fréquence et l’occurrence des marques combinatoires d’histones sont montrés.

Introduction

Depuis la fin du^19e siècle, les systèmes de culture cellulaire ont été utilisés comme modèle pour étudier la croissance et le développement des cellules en dehors du corps humain ^1,2. Leur utilisation a également été étendue pour étudier le fonctionnement des tissus et des organes dans des contextes sains et malades ^1,3. Les cellules en suspension (p. ex. les cellules sanguines) se développent dans des boîtes de Pétri ou des flacons de façon transparente et interchangeable, car elles ne s’assemblent pas dans des structures tridimensionnelles (3D) in vivo. Les cellules dérivées d’organes solides peuvent se développer dans des systèmes de culture bidimensionnels (2D) ou 3D. En culture 2D, les cellules sont cultivées dans une monocouche qui adhère à une surface plane ^2,4. Les systèmes de culture cellulaire 2D sont caractérisés par une croissance exponentielle et un temps de doublement rapide, généralement de 24 h à quelques jours⁵. Les cellules des systèmes 3D se développent pour former des interactions cellules-cellules complexes en modélisant plus étroitement des conglomérats tissulaires, et elles se caractérisent par leur capacité à atteindre un équilibre dynamique où leur temps de doublement peut atteindre 1 mois ou plus⁵.

Présenté dans cet article est une méthodologie innovante pour cultiver des sphéroïdes 3D dans des systèmes de culture cellulaire rotatifs qui simulent une gravité réduite⁶. Il s’agit d’un dérivé simplifié d’un système de culture cellulaire introduit par la NASA dans les années 1990⁷. Cette approche minimise les forces de cisaillement, qui se produisent dans les méthodes existantes comme la filature des flacons, et augmente la reproductibilité des sphéroïdes⁶. En outre, le bioréacteur rotatif augmente la diffusion active des nutriments, minimisant la formation nécrotique qui se produit dans des systèmes tels que la culture cellulaire suspendue où l’échange de milieux n’est pas pratique⁶. De cette façon, les cellules se développent la plupart du temps sans être dérangées, ce qui permet la formation de caractéristiques structurelles et physiologiques associées à la croissance des cellules dans les tissus. Les hépatocytes C3A (HepG2/C3A) cultivés de cette manière avaient non seulement des organites ultrastructuraux, mais produisaient également des quantités d’ATP, d’adénylate kinase, d’urée et de cholestérol comparables aux niveaux observés in vivo ^1,2. En outre, les cellules cultivées en 2D par rapport aux systèmes de culture cellulaire .3D présentent des modèles d’expression génique différents⁸. L’analyse de l’expression génique des hépatocytes C3A cultivés sous forme de sphéroïdes 3D a montré que ces cellules exprimaient un large éventail de protéines spécifiques au foie, ainsi que des gènes impliqués dans des voies clés qui régulent la fonction hépatique⁸. Des publications antérieures ont démontré les différences entre les protéomes de cellules à croissance exponentielle en culture 2D et les cellules à l’équilibre dynamique dans les cultures sphéroïdes 3D⁵. Ces différences incluent le métabolisme cellulaire, qui à son tour affecte la structure, la fonction et la physiologie de la cellule⁵. Le protéome des cellules cultivées en culture 2D était plus enrichi en protéines impliquées dans la réplication cellulaire, tandis que le protéome des sphéroïdes 3D était plus enrichi en fonctionnalité hépatique⁵.

Le taux de réplication plus lent des cellules cultivées sous forme de sphéroïdes 3D modélise plus précisément des phénomènes spécifiques associés à l’état et aux modifications de la chromatine (par exemple, coupure d’histone⁹). L’écrêtage des histones est une modification post-traductionnelle irréversible des histones (PTM) qui provoque un clivage protéolytique d’une partie de la queue N-terminale de l’histone. Bien que sa fonction biologique soit encore en discussion 10,11,12,13, il est clair que sa présence dans les cellules primaires et les tissus hépatiques est modélisée par des cellules HepG2/C3A cultivées sous forme de sphéroïdes, mais pas sous forme de cellules plates 9. Ceci est essentiel, car l’état et les modifications de la chromatine régulent la lecture de l’ADN principalement en modulant l’accessibilité aux gènes et donc leur expression¹⁴. Les PTM d’histone influencent soit directement l’état de la chromatine en affectant la charge nette des nucléosomes où les histones sont assemblées, soit indirectement en recrutant des écrivains, des lecteurs et des gommes à base de chromatine¹⁴. Des centaines de PTM d’histones ont été identifiés à ce jour¹⁵, renforçant l’hypothèse selon laquelle la chromatine héberge un « code d’histone » utilisé par la cellule pour interpréter l’ADN¹⁶. Cependant, l’identification d’une myriade de combinaisons ptm¹⁵ et la découverte que les combinaisons de PTM d’histones ont souvent des fonctions biologiques différentes des PTM présents isolément (par exemple, Fischle et ^al.17), soulignent que davantage de travail est nécessaire pour déchiffrer le « code des histones ».

À l’heure actuelle, l’analyse ptm des histones est soit basée sur des techniques utilisant des anticorps (par exemple, transferts de Western, immunofluorescence ou immunoprécipitation de la chromatine suivie d’un séquençage [ChIP-seq]) ou la spectrométrie de masse (SEP). Les techniques à base d’anticorps ont une sensibilité élevée et peuvent fournir des informations détaillées sur la localisation des marques d’histones à l’échelle du génome, mais sont souvent limitées dans l’étude des PTM rares ou des PTM présents dans des combinaisons 18,19,20. La SEP est plus adaptée à l’identification et à la quantification à haut débit et non biaisées des modifications protéiques uniques et coexistantes, en particulier les protéines histones 18,19,20. Pour ces raisons, ce laboratoire et plusieurs autres ont optimisé le pipeline de SEP pour l’analyse des peptides d’histones (SEP ascendante), des queues d’histones intactes (SEP moyennement descendante) et des protéines d’histones pleine longueur (MS descendante)21,22,23.

Vous trouverez ci-dessous un flux de travail pour la culture des sphéroïdes HepG2 / C3A et leur préparation à l’analyse peptidique des histones (MS ascendante) par chromatographie nano-liquide, couplée en ligne à la spectrométrie de masse en tandem (nLC-MS / MS). Une culture cellulaire 2D a été cultivée et les cellules ont été récoltées et transférées dans un bioréacteur où elles ont commencé à former des sphéroïdes (Figure 1). Après 18 jours de culture, les sphéroïdes ont été traités avec du butyrate de sodium ou du succinate de sodium pour augmenter les abondances relatives d’acétylation et de succinylation des histones. Notamment, les cultures 3D peuvent être traitées avec des composés génotoxiques tout aussi bien que leurs équivalents de culture plate; en fait, des publications récentes soulignent que la réponse toxicologique des cellules en culture 3D est plus similaire aux tissus primaires que celles en culture plate 2D^24,25. Les cellules ont ensuite été collectées à des moments précis et l’isolement nucléaire a été effectué. Ensuite, les histones ont été extraites et dérivées avec de l’anhydride propionique avant et après la digestion de la trypsine selon un protocole développé pour la première fois par Garcia et ^al.26. Cette procédure génère des peptides d’une taille appropriée pour la séparation en ligne avec chromatographie en phase inversée (C₁₈) et la détection avec MS. Enfin, les peptides d’histones ont été identifiés et quantifiés, et les données générées ont été représentées de multiples façons pour une interprétation biologique plus complète.

Protocol

1. Préparation des tampons et des réactifs Milieux de croissance cellulaire (pour les cellules HepG2/C3A) : Ajouter le sérum fœtal bovin (FBS) (10 % v/v), les acides aminés non essentiels (1 % v/v), le supplément de L-glutamine (1 % v/v) et la pénicilline/streptomycine (0,5 % v/v) au milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM, contenant 4,5 g/L de glucose). Les milieux de croissance sont conservés à 4 °C pendant un maximum de 2 semaines. Solution de butyrate de sodium (NaBu…

Representative Results

Dans ce protocole, les sphéroïdes HepG2/C3A ont été traités avec 20 mM de NaBut et 10 mM de NaSuc, qui ont tous deux affecté les niveaux globaux d’histones PTM (Figure 3A). Les PTM d’histones ont ensuite été identifiés et quantifiés au niveau de résidu unique par acquisition de MS/MS (Figure 3B). Lorsque les échantillons sont exécutés en répétitions, une analyse statistique peut être effectuée pour éval…

Discussion

L’analyse des PTM d’histones est fondamentalement différente du pipeline d’analyse protéomique typique. La plupart des PTM d’histones ont encore des fonctions biologiques énigmatiques; par conséquent, les annotations telles que l’ontologie des gènes ou les bases de données de voies ne sont pas disponibles. Il existe plusieurs ressources qui associent les modifications des histones à l’enzyme responsable de leur catalyse ou aux protéines contenant des domaines qui lient ces PTM (par exemple, HISTome<su…

Materials

0.05% trypsin-EDTA solution	Gibco	25300054
0.5-20 µL pipet tips	BRAND	13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubes	Bio-Rad	2239480
10 µL multi-channel pipette	BRAND	BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringe	Henke Sass Wolf	14-817-31 (Fisher Scientific)	Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes	Eppendorf	14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tips	Rainin	30389164
18 G syringe needle	Air-Tite	14-817-100 (Fisher Scientific)	3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipette	Corning	4082
2-200 µL pipet tips	BRAND	Z740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplate	Corning	07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flask	Corning	461464U	Untreated, with vent cap
96-well skirted plate	Axygen	PCR-96-FS-C (Corning)
Acetone	Fisher Scientific	A949-1	Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	A6141-25G
Ammonium hydroxide solution	Fisher Scientific	AC423300250
Cell culture grade water	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar	CelVivo	N/A	Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unit	CelVivo	N/A	Tablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	17-205-CV	1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV
Formic acid	Thermo Scientific	28905
Fume hood	Mott	N/A	Model 7121000
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-8B	9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplement	Corning	25-015-CI	200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W6-1
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific	A481-212
Ice	N/A	N/A
MEM non-essential amino acids	Corning	25-025-CI	100X solution
Oasis HLB resin	Waters	186007549	Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	High resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plate	Orochem	OF1100	96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI	100X solution
pH paper	Hydrion	Z111848 (Sigma-Aldrich)	0-13 pH test paper
Pipette gun	Eppendorf	Z666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillary	Molex	50-110-7740 (Fisher Scientific)	Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile	Fisher Scientific	1367549
Propionic anhydride	Sigma-Aldrich	240311-50G
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420
Reprosil-Pur resin	MSWIL	R13.AQ.0003	120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
Rotator	Clay Adams	25477 (American Laboratory Trading)	Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sodium butyrate	Thermo Scientific	A11079
Sodium succinate dibasic	Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes)	Savant	20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well)	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
Sterile hood	Thermo Scientific	1375	Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4)	Fisher Scientific	02-004-375	Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish	Fisher Scientific	08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA)	Thermo Scientific	AC421451000	Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA)	Fisher Scientific	PI28904	Sequencing grade
Vacuum manifold 96-well	Millipore	MAVM0960R
Vortex	Sigma-Aldrich	Z258415
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µL	Axygen	14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µL	Axygen	14-222-730 (Fisher Scientific)