Isolamento, espansione e differenziazione delle cellule staminali mesenchimali dal cuscinetto di grasso infrarotuleo dell'articolazione soffocante della capra

Summary

Le cellule staminali mesenchimali infrarotulee (IFP-MSC) possono essere isolate facilmente dal cuscinetto adiposo infrarotuleo dell’articolazione del ginocchio. Proliferano bene in vitro, formano colonie CFU-F e si differenziano in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche. Qui viene fornita la metodologia per l’isolamento, l’espansione e la differenziazione delle IFP-MSC dall’articolazione del soffocamento della capra.

Abstract

L’IFP, presente nell’articolazione del ginocchio, funge da fonte promettente di MSC. L’IFP è un tessuto facilmente accessibile in quanto viene regolarmente resecato e scartato durante le procedure artroscopiche e gli interventi chirurgici di sostituzione del ginocchio. Inoltre, la sua rimozione è associata a una morbilità minima del sito donatore. Studi recenti hanno dimostrato che le IFP-MSC non perdono la loro capacità di proliferazione durante l’espansione in vitro e hanno un potenziale di differenziazione osteogenica indipendente dall’età. Le IFP-MSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogena superiore rispetto alle MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) e alle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC). Sebbene queste cellule siano facilmente ottenibili da pazienti anziani e malati, la loro efficacia è limitata. Pertanto, l’utilizzo di IFP-MSC da donatori sani è importante per determinare la loro efficacia nelle applicazioni biomediche. Poiché l’accesso a un donatore umano sano è difficile, i modelli animali potrebbero essere un’alternativa migliore per consentire la comprensione fondamentale. Grandi animali come cani, cavalli, pecore e capre svolgono un ruolo cruciale nella ricerca traslazionale. Tra questi, la capra potrebbe essere un modello preferito poiché l’articolazione soffocante della capra ha l’anatomia più vicina all’articolazione del ginocchio umano. Inoltre, l’IFP di capra può soddisfare i numeri MSC più elevati necessari per le applicazioni di rigenerazione dei tessuti. Inoltre, il basso costo, la disponibilità e la conformità ai principi 3R per la ricerca sugli animali li rendono un modello attraente. Questo studio dimostra un semplice protocollo per isolare le IFP-MSC dall’articolazione soffocante delle capre e dalle condizioni di coltura in vitro per la loro espansione e differenziazione. L’IFP asettico isolato dalla capra è stato lavato, tritato e digerito enzimaticamente. Dopo la filtrazione e la centrifugazione, le cellule raccolte sono state coltivate. Queste cellule erano aderenti, avevano una morfologia simile alle MSC e dimostravano una notevole capacità clonogenica. Inoltre, si sono differenziati in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche, dimostrando la loro multipotenza. In conclusione, lo studio dimostra l’isolamento e l’espansione delle MSC, che mostrano il potenziale nelle applicazioni di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa.

Introduction

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono un candidato interessante per le terapie cellulari nella medicina rigenerativa ^1,2. Possono essere raccolti da una varietà di fonti tissutali come midollo osseo, cordone ombelicale, placenta, polpa dentale e tessuto adiposo sottocutaneo³. Tuttavia, poiché la disponibilità di cellule staminali negli adulti è limitata e la loro procedura di isolamento è spesso invasiva (con conseguente morbilità del sito donatore), è auspicabile avere una fonte alternativa di cellule staminali che potrebbe aggirare queste sfide.

L’articolazione del ginocchio è un deposito di vari tipi di cellule, come MSC derivate da cuscinetti di grasso infrarotuleo, MSC derivate dalla membrana sinoviale, MSC derivate dal liquido sinoviale, fibroblasti legamentosi, condrociti articolari, ecc ^4,5,6. Queste cellule hanno il potenziale per essere ampiamente esplorate nella ricerca basata sull’ingegneria dei tessuti muscoloscheletrici. Pertanto, l’articolazione del ginocchio potrebbe essere una fonte possibile e affidabile di più tipi di MSC. Il deposito adiposo situato nell’articolazione del ginocchio, noto come cuscinetto adiposo infrarotuleo (IFP) o cuscinetto adiposo di Hoffa, è una scelta promettente e alternativa del deposito MSC. L’IFP è una fonte relativamente facilmente accessibile e clinicamente ottenibile di MSC, poiché viene regolarmente resecata e scartata come rifiuto chirurgico durante l’artroscopia del ginocchio o la chirurgia del ginocchio aperto. La rimozione dell’IFP è associata a una morbilità minima del sito donatore, che lo rende anche una fonte di tessuto attraente. Pur avendo un profilo fenotipico simile, le MSC da IFP (IFP-MSCs) hanno un potenziale clonogenico aumentato rispetto alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSCs)⁶ e una migliore capacità proliferativa rispetto alle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo sottocutaneo (ADSC)⁷. È interessante notare che, rispetto alle MSC derivate dal liquido sinoviale (SF-MSCs), le IFP-MSC non perdono la loro capacità proliferativa nei passaggi tardivi, né il tempo di raddoppio aumenta nei passaggi tardivi. Ciò suggerisce che, durante l’espansione cellulare, le IFP-MSC possono raggiungere un numero sufficientemente elevato di cellule per applicazioni di ingegneria tissutale in vitro senza compromettere il loro tasso di proliferazione⁸. Studi recenti hanno anche suggerito che le IFP-MSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogena superiore rispetto alle MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) e alle MSC derivate dal tessuto adiposo (ADSC), probabilmente a causa della loro vicinanza anatomica alla cartilagine articolare, indicando la loro idoneità per l’ingegneria del tessuto cartilagineo 6,7,9,10. Inoltre, possiedono anche un potenziale di differenziazione osteogenica indipendente dall’et๹. È stato dimostrato che l’iniezione intra-articolare di IFP-MSCs riduce il dolore e migliora le funzioni articolari del ginocchio nei pazienti con osteoartrite (OA)^12,13. Inoltre, sono state riportate anche forti risposte immunosoppressive e migliori proprietà immunomodulatorie delle IFP-MSCs in presenza di citochine infiammatorie durante condizioni patologiche⁶.

Le IFP-MSC sono una fonte promettente e alternativa di MSC; Tuttavia, il loro beneficio terapeutico nell’ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa è relativamente meno esplorato. Gli studi esistenti sulle IFP-MSC hanno utilizzato principalmente cellule provenienti da donatori umani. Tra questi, alcuni studi recenti hanno indagato IFP-MSC da donatori umani sani (pazienti non artritici, di età compresa tra 17 e 60 anni)^6,14, mentre la maggior parte degli studi ha utilizzato IFP-MSC di pazienti anziani sottoposti a chirurgia sostitutiva totale del ginocchio (pazienti malati, età 70-80 anni). Poiché sia l’età che la malattia sono note per alterare il normale funzionamento delle cellule staminali (numero ridotto e perdita di potenziale funzionale), ciò potrebbe potenzialmente portare a incongruenze nei risultati degli studi basati su MSC 7,15,16,17. Inoltre, l’uso di IFP-MSCs da pazienti con condizioni fisiopatologiche (ad esempio, artrite e obesità) pone anche difficoltà per la comprensione delle caratteristiche di base delle cellule sane in vitro, agendo così come fattore limitante nello sviluppo di terapie basate su MSC. Per superare questi problemi, l’uso di IFP-MSC da donatori sani è vitale. Poiché l’accesso a un donatore umano sano è impegnativo, i modelli animali potrebbero essere un’alternativa migliore. A questo proposito, ci sono alcuni studi in cui IFP è stato isolato dai topi¹⁸. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni del cuscinetto adiposo nei topi normali, i tessuti grassi di più animali sono stati combinati per ottenere abbastanza tessuto per eseguire elaborate procedure sperimentali¹⁹. Quindi, c’è bisogno di un modello animale di grandi dimensioni, che potrebbe soddisfare il requisito per il maggior numero di cellule e contemporaneamente rispettare i principi 3R (perfezionare, sostituire e ridurre) nella ricerca sugli animali²⁰. L’uso di grandi animali ha implicazioni significative nella ricerca traslazionale. In particolare, nell’ingegneria dei tessuti muscoloscheletrici, è stata studiata una serie di animali di grandi dimensioni come cani, maiali, pecore, capre e cavalli²¹. La capra (Capra aegagrus hircus) è un’ottima scelta di animali di grandi dimensioni poiché la sua articolazione soffocante ha l’anatomia più vicina all’articolazione del ginocchio umano^22,23,24. La struttura trabecolare ossea subcondrale e lo spessore osseo subcondrale delle capre sono simili a quelli degli esseri umani, e la proporzione della cartilagine rispetto all’osso è anche segnalata per essere vicina agli esseri umani²¹. Inoltre, le capre sono state ampiamente addomesticate in tutto il mondo, rendendole facilmente disponibili quando sono scheletricamente mature. Inoltre, i bassi costi di manutenzione e la facilità d’uso li hanno resi un modello animale attraente per la ricerca²².

Nel presente studio viene dimostrato un semplice protocollo per l’isolamento delle IFP-MSC dall’articolazione soffocante di Capra aegagrus hircus (capra) e le condizioni di coltura in vitro per la loro espansione e differenziazione. Le cellule isolate sono aderenti, hanno morfologia simile alle MSC, formano colonie CFU-F (unità formanti colonie-fibroblasti) e possiedono un potenziale di differenziazione adipogenico, condrogeno e ostegenico. Pertanto, le IFP-MSC mostrano il potenziale come fonte alternativa di MSC per applicazioni biomediche.

Protocol

Il protocollo si basa sull’isolamento delle IFP-MSC dalle capre. Capra IFP e sangue sono stati raccolti da un mattatoio locale. Poiché tali collezioni di tessuti sono al di fuori della competenza di un comitato etico istituzionale per gli animali, non era richiesta l’approvazione etica. 1. Isolamento delle IFP-MSC dall’articolazione femorotibiale del ginocchio di capra Raccogliere l’articolazione femorotibiale della capra (campione) che comprende ~ 15 cm ciascuna de…

Representative Results

Isolamento delle IFP-MSC dall’articolazione femorotibiale della capraLe fasi coinvolte nell’isolamento delle IFP-MSC dall’articolazione soffocante di una capra sono illustrate nella Figura 1. Il cuscinetto adiposo presente nella superficie interna non articolata della rotula è stato rimosso, tritato e digerito enzimaticamente. Le IFP-MSC sono state isolate e coltivate con successo in vitro (Figura 2A). <…

Discussion

Nel presente protocollo è stato fornito un metodo semplice, affidabile e riproducibile per l’isolamento delle MSC dall’IFP caprino. Le cellule isolate con questo metodo sono state utilizzate con successo nei nostri precedenti studi per la rigenerazione tissutale in vitro. È stato osservato che le cellule isolate erano proliferative, rispondevano a vari fattori di crescita e conservavano la loro attività biologica quando seminate su fibre elettrofilate e scaffold^25,26<sup cla…

Materials

β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15-mL centrifuge tube	Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	50 µg/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL centrifuge tube	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	For calcium deposition
Amphotericin B	HiMedia	A011	2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate	Sigma	B5655-5TAB	For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA	HiMedia	MB-083	Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer	HiMedia	TCP-182	70 µm
Centrifuge	REMI
Ciprofloxacin	RANBAXY LAB. Limited	B17407T1	2.5 µg/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 µM
DMEM LG	SIGMA	D5523	Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%	Merck	61780805001730
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 µM
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	10 µg/mL
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Magnesium chloride	Merck	61751605001730	For lysis buffer
Methanol	Meck	1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)	Thermoscientific
MUSE Cell analyser	Merck Millipore		For cell counting
OCT compound	Tissue-Tek	4583	Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye	S D Fine-Chem Limited	54304	For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	C3434	3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels			For isolation of IFP-MSC
Sucrose	Merck	1.94953.0521	35 % (w/v)
TGF-β1	Sino Biologicals		Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	For lysis buffer
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	For lysis buffer
Type II collagenase	Gibco	17101015	1.5 mg/mL
Vitamin D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)	NEST