Isolering, ekspansion og differentiering af mesenkymale stamceller fra den infrapatellære fedtpude i gedekvæleleddet

Summary

Infrapatellar fedtpude mesenkymale stamceller (IFP-MSC’er) kan let isoleres fra knæleddets infrapatellære fedtpude. De formerer sig godt in vitro, danner CFU-F-kolonier og differentierer sig til adipogene, kondrogene og osteogene slægter. Heri gives metoden til isolering, udvidelse og differentiering af IFP-MSC’er fra gedekvælningsled.

Abstract

IFP, der findes i knæleddet, fungerer som en lovende kilde til MSC’er. IFP er et let tilgængeligt væv, da det rutinemæssigt resekteres og kasseres under artroskopiske procedurer og knæudskiftningsoperationer. Derudover er dens fjernelse forbundet med minimal morbiditet på donorstedet. Nylige undersøgelser har vist, at IFP-MSC’er ikke mister deres spredningskapacitet under in vitro-ekspansion og har aldersuafhængigt osteogent differentieringspotentiale. IFP-MSC’er har overlegen kondrogen differentieringspotentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte MSC’er (BMSC’er) og fedtafledte stamceller (ADSC’er). Selvom disse celler let kan fås fra ældre og syge patienter, er deres effektivitet begrænset. Derfor er det vigtigt at bruge IFP-MSC’er fra raske donorer for at bestemme deres effektivitet i biomedicinske applikationer. Da adgang til en sund menneskelig donor er udfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ til at muliggøre grundlæggende forståelse. Store dyr som hunde, heste, får og geder spiller en afgørende rolle i translationel forskning. Blandt disse kunne geden være en foretrukken model, da gedens kvæleled har den nærmeste anatomi til det menneskelige knæled. Desuden kan gede-IFP opfylde de højere MSC-numre, der er nødvendige for vævsregenereringsapplikationer. Desuden gør lave omkostninger, tilgængelighed og overholdelse af 3R-principperne for dyreforsøg dem til en attraktiv model. Denne undersøgelse demonstrerer en simpel protokol til isolering af IFP-MSC’er fra gedens kvæleled og in vitro-kulturbetingelser for deres ekspansion og differentiering. Den aseptisk isolerede IFP fra geden blev vasket, hakket og fordøjet enzymatisk. Efter filtrering og centrifugering blev de opsamlede celler dyrket. Disse celler var klæbende, havde MSC’er-lignende morfologi og viste bemærkelsesværdig klonogen evne. Endvidere differentierede de sig i adipogene, kondrogene og osteogene slægter, hvilket demonstrerede deres multipotens. Afslutningsvis viser undersøgelsen isolering og udvidelse af MSC’er, som viser potentiale inden for vævsteknik og regenerativ medicin.

Introduction

Mesenkymale stamceller (MSC’er) er en attraktiv kandidat til cellebaserede terapier inden for regenerativ medicin ^1,2. De kan høstes fra en række vævskilder såsom knoglemarv, navlestreng, placenta, tandmasse og subkutant fedtvæv³. Da tilgængeligheden af stamceller hos voksne imidlertid er begrænset, og deres isolationsprocedure ofte er invasiv (hvilket resulterer i sygelighed på donorstedet), er det ønskeligt at have en alternativ stamcellekilde, der kan omgå disse udfordringer.

Knæleddet er et depot af forskellige celletyper, såsom infrapatellar fedtpudeafledte MSC’er, synoviale membranafledte MSC’er, synovialvæskeafledte MSC’er, ligamentfibroblaster, artikulære chondrocytter osv. ^4,5,6. Disse celler har potentiale til at blive bredt udforsket i muskuloskeletale vævsteknologibaserede undersøgelser. Derfor kan knæleddet være en mulig og pålidelig kilde til flere typer MSC’er. Fedtdepot placeret i knæleddet, kendt som den infrapatellar fedtpude (IFP) eller Hoffas fedtpude, er et lovende og alternativt valg af MSC-depot. IFP er en relativt let tilgængelig og klinisk tilgængelig kilde til MSC’er, da den rutinemæssigt resekteres og kasseres som kirurgisk affald under knæartroskopi eller åben knæoperation. Fjernelse af IFP er forbundet med minimal morbiditet på donorstedet, hvilket også gør det til en attraktiv vævskilde. MSC’er fra IFP (IFP-MSC’er) har en lignende fænotypisk profil, men har forbedret klonogent potentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller (BM-MSC’er)⁶ og bedre proliferativ kapacitet sammenlignet med subkutane fedtafledte stamceller (ADSC’er)⁷. Interessant nok mister IFP-MSC’er sammenlignet med synovialvæskeafledte MSC’er (SF-MSC’er) ikke deres proliferative kapacitet ved sene passager, og fordoblingstiden øges heller ikke ved sene passager. Dette tyder på, at IFP-MSC’er under celleekspansion kan opnå et tilstrækkeligt stort antal celler til in vitro-vævstekniske applikationer uden at gå på kompromis med deres spredningshastighed⁸. Nylige undersøgelser har også antydet, at IFP-MSC’er har overlegen kondrogen differentieringspotentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte MSC’er (BMSC’er) og fedtafledte MSC’er (ADSC’er), sandsynligvis på grund af deres anatomiske nærhed til ledbrusk, hvilket indikerer deres egnethed til bruskvævsteknik 6,7,9,10. Desuden har de også aldersuafhængigt osteogent differentieringspotentiale¹¹. Intraartikulær injektion af IFP-MSC’er har vist sig at reducere smerter og forbedre knæledsfunktioner hos patienter med slidgigt (OA)^12,13. Endvidere er der også rapporteret stærke immunsuppressive reaktioner og forbedrede immunmodulerende egenskaber af IFP-MSC’er i nærvær af inflammatoriske cytokiner under patologiske tilstande⁶.

IFP-MSC’er er en lovende og alternativ kilde til MSC’er; Imidlertid er deres terapeutiske fordel inden for vævsteknik og regenerativ medicin relativt mindre udforsket. De eksisterende undersøgelser af IFP-MSC’er har hovedsageligt udnyttet celler fra menneskelige donorer. Blandt disse har nogle få nylige undersøgelser undersøgt IFP-MSC’er fra raske humane donorer (ikke-gigtpatienter, i alderen 17-60 år)^6,14, mens de fleste af undersøgelserne har brugt IFP-MSC’er fra ældre patienter, der gennemgår total knæalloplastik (syge patienter, alder 70-80 år). Da både alder og sygdom vides at ændre stamcellernes normale funktion (reduceret antal og tab af funktionelt potentiale), kan dette potentielt føre til uoverensstemmelser i resultatet af de MSC-baserede studier 7,15,16,17. Derudover giver brugen af IFP-MSC’er fra patienter med patofysiologiske tilstande (f.eks. arthritis og fedme) også svært ved at forstå de grundlæggende egenskaber ved sunde celler in vitro og fungerer dermed som en begrænsende faktor i udviklingen af MSC-baserede terapier. For at overvinde disse problemer er brugen af IFP-MSC’er fra raske donorer afgørende. Da adgang til en sund menneskelig donor er udfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ. I denne henseende er der et par undersøgelser, hvor IFP er blevet isoleret fra mus¹⁸. På grund af fedtpudens lille størrelse i normale mus er fedtvæv fra flere dyr imidlertid blevet kombineret for at få nok væv til at udføre detaljerede eksperimentelle procedurer¹⁹. Derfor er der behov for en stor dyremodel, der kan opfylde kravet om det højere antal celler og samtidig overholde 3R-principperne (forfine, erstatte og reducere) i dyreforsøg²⁰. Brugen af store dyr har betydelige konsekvenser i translationel forskning. Specifikt inden for muskuloskeletal vævsteknik er en række store dyr som hunde, svin, får, geder og heste blevet undersøgt²¹. Geder (Capra aegagrus hircus) er et glimrende valg af store dyr, da dets kvæleled har den nærmeste anatomi til det menneskelige knæled^22,23,24. Den subchondral knogletrabekulære struktur og subchondral knogletykkelse hos geder ligner mennesker, og andelen af brusk til knogle rapporteres også at være tæt på mennesker²¹. Derudover er geder blevet bredt tæmmet over hele verden, hvilket gør dem let tilgængelige, når de er skeletmodne. Desuden har lave vedligeholdelsesomkostninger og nem håndtering gjort dem til en attraktiv dyremodel til forskning²².

I denne undersøgelse demonstreres en simpel protokol til isolering af IFP-MSC’er fra kvæleleddet af Capra aegagrus hircus (ged) og in vitro-dyrkningsbetingelser for deres ekspansion og differentiering. De isolerede celler er klæbende, har MSC-lignende morfologi, danner CFU-F (kolonidannende enhedsfibroblast) kolonier og besidder adipogen, kondrogene og osteogene differentieringspotentialer. Derfor viser IFP-MSC’er potentiale som en alternativ kilde til MSC’er til biomedicinske applikationer.

Protocol

Protokollen er baseret på isolering af IFP-MSC’er fra geder. Geder IFP og blod blev indsamlet fra et lokalt slagteri. Da sådanne vævssamlinger ligger uden for en institutionel dyreetisk komités ansvarsområde, var etisk godkendelse ikke påkrævet. 1. Isolering af IFP-MSC’er fra lårbensleddet i gedeknæet Saml gedens femorotibiale led (prøve), der omfatter ~ 15 cm hver af lårbens- og tibialområderne i bagbenene. Prøven anbringes straks i en steriliseret prø…

Representative Results

Isolering af IFP-MSC’er fra gedens femorotibiale ledDe trin, der er involveret i isolering af IFP-MSC’er fra en geds kvæleled, er afbildet i figur 1. Fedtpuden til stede i den indre ikke-artikulerende overflade af patella blev fjernet, hakket og enzymatisk fordøjet. IFP-MSC’erne blev med succes isoleret og dyrket in vitro (figur 2A). Udvidelse og klonogen evne af IFP-MSC’erDe isoler…

Discussion

I denne protokol er der tilvejebragt en enkel, pålidelig og reproducerbar metode til isolering af MSC’er fra ged IFP. Celler isoleret ved hjælp af denne metode er blevet anvendt med succes i vores tidligere undersøgelser til in vitro vævsregenerering. Det blev observeret, at de isolerede celler var proliferative, reagerede på forskellige vækstfaktorer og bevarede deres biologiske aktivitet, når de blev podet på elektrospundne fibre og stilladser^25,26</…

Materials

β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422-10G	10 mM
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA	Hi-Media	TCL049
15-mL centrifuge tube	Corning
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	50 µg/mL
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	HiMedia	TCL021-50ml	10 mM
50-mL centrifuge tube	Corning
Alcian Blue	Hi-Media	RM471	For sufated gycosaminoglycans staining
Alizarin Red S	S D Fine-Chem Limited	26048-25G	For calcium deposition
Amphotericin B	HiMedia	A011	2.5 µg/mL
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Sino Biologicals	10014-HNAE	5 ng/mL
BCIP/NBT ALP Substrate	Sigma	B5655-5TAB	For ALP staining
Biological safety cabinet
BSA	HiMedia	MB-083	Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL )
Cell strainer	HiMedia	TCP-182	70 µm
Centrifuge	REMI
Ciprofloxacin	RANBAXY LAB. Limited	B17407T1	2.5 µg/mL
Crystal Violet	S D Fine-Chem Limited	42555
D(+)-glucose	Merck	1.94925.0521	25 mM
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 µM
DMEM LG	SIGMA	D5523	Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose
Ethanol	Merck	100983
FBS	Gibco	10270	Long name: Fetal Bovine Serum
Formaldehyde solution 37%-41%	Merck	61780805001730
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378	100 µM
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	10 µg/mL
Inverted microscope	Nikon Eclipse TS 100
ITS + 1	Sigma-Aldrich	I2521-5mL	Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA
L-Proline	HiMedia	TO-109-25G	1 mM
Magnesium chloride	Merck	61751605001730	For lysis buffer
Methanol	Meck	1.07018.2521
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL)	Thermoscientific
MUSE Cell analyser	Merck Millipore		For cell counting
OCT compound	Tissue-Tek	4583	Long name: Optimal Cutting Temperature
Oil Red O dye	S D Fine-Chem Limited	54304	For lipid vacuole staining
Penicillin-Streptomycin	HiMedia	A007	100 U/mL
Petri dishes (150 mm and 90 mm)	NEST
Safranin O	S D Fine-Chem Limited	50240	For sufated gycosaminoglycans staining
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	C3434	3.4 % (w/v)
Sterile scissors, forceps and scalpels			For isolation of IFP-MSC
Sucrose	Merck	1.94953.0521	35 % (w/v)
TGF-β1	Sino Biologicals		Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL)
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Thermoscientific
Tris buffer	Merck	61771405001730	For lysis buffer
Triton X100	S D Fine-Chem Limited	40632	For lysis buffer
Type II collagenase	Gibco	17101015	1.5 mg/mL
Vitamin D3	Sigma	C9756-1G	10 nM
Well plates (6 -WP and 24-WP)	NEST