基于FDR对照的非靶向代谢组的鉴定和定量集成工作流程
Summary
我们构建了一个非靶向代谢组学工作流程，将XY-Meta和metaX集成在一起。在该协议中，我们展示了如何使用XY-Meta从开放获取光谱参考中生成诱饵光谱库，然后进行FDR控制，并在鉴定代谢组学光谱后使用metaX定量代谢物。
Abstract
近年来，非靶向代谢组学技术被广泛使用。然而，快速增加的通量和样品数量会产生大量的光谱，这给质谱光谱的质量控制带来了挑战。为了减少误报，必须进行错误发现率（FDR）质量控制。最近，我们开发了一种用于FDR控制非靶向代谢组鉴定的软件，该软件基于名为XY-Meta的目标诱饵策略。在这里，我们演示了一个完整的分析管道，它将 XY-Meta 和 metaX 集成在一起。该协议展示了如何使用XY-meta从现有参考数据库生成诱饵数据库，并使用Target-诱饵策略在开放获取数据集上进行大规模代谢组鉴定来执行FDR控制。差异分析和代谢物注释是在运行metaX进行代谢物峰检测和定量后进行的。为了帮助更多的研究人员，我们还为这些分析开发了一个用户友好的基于云的分析平台，无需生物信息学技能或任何计算机语言。
Introduction
代谢物在生物过程中起着重要作用。代谢物通常是各种过程的调节剂，如能量转移，激素调节，神经递质调节，细胞通讯和蛋白质翻译后修饰等1，2，3，4。非靶向代谢组学提供了许多代谢物的全球视图5，6。随着质谱和色谱技术的进步，代谢组MS/MS谱的通量近年来迅速增加7，8，9，10，11。为了从这些庞大的数据集中鉴定代谢物，开发了各种注释软件11，例如MZmine12，MS-FINDER13，CFM-ID14，MetFrag15和SLAW16。但是，这些标识通常包含许多误报。原因包括：（1）MS/MS光谱包含随机噪声，这可能会误导峰值匹配。（2）异构体和碎片能量的差异导致多个光谱指纹，从而增加参考库的体积。（3） 参考库的质量各不相同。需要一个适当的标准来建立一个良好的参考光谱库。因此，非目标代谢组学的系统性错误发现率（FDR）控制对于功能代谢组研究7，8，9，17至关重要。
经验贝叶斯方法和目标诱饵策略都普遍解决了罗斯福的控制问题。Kerstin Scheubert等人认为，基于碎片树的方法对诱饵数据库生成的目标诱饵策略是FDR控制9的最佳方法。王旭生等人设计了一种基于化学八位字节规则的诱饵生成方法，提高了FDR估计的精度17。演示了用于生成诱饵数据库的光谱库以获得更好的性能18.在这里，我们改进了基于光谱库的方法，并开发了一种名为XY-Meta19 的软件，可以进一步提高FDR估计的精度。它使用现有的参考光谱库为目标诱饵方案下的 FDR 控制生成诱饵库。XY-Meta 支持自己的光谱匹配和余弦相似性算法。它允许传统的搜索和迭代搜索模式。在 FDR 评估的步骤中，它支持目标诱饵串联模式和分离模式。为了获得更好的灵活性，XY-Meta 接受外部诱饵库。
代谢物的峰检测和定量也是非靶向代谢组分析的重要步骤。峰检测是代谢组鉴定的主要方法。一般而言，代谢物峰检测的准确性受多种因素的影响，如质谱的噪声信号、代谢物丰度低、污染物、代谢物降解产物20等。当样品数量过多或液相色谱柱被非靶向代谢组实验替换时，可能会出现显著的批次效应，这是代谢组定量的主要挑战21、22、23。目前，XCMS24、Workflow4蛋白质25、iMet-Q26和metaX19 等软件可以对非靶向代谢组进行峰检测和定量，但我们建议metaX的管道更完整，更易于使用。在这里，我们演示了使用XY-Meta的公开数据集msv000084112的鉴定和FDR控制过程，以及使用metaX对代谢物的峰检测和定量。此工作流只需要两个组，每个组至少需要两个样本。无论质谱仪平台、电离模式、电荷模式和样品类型如何，都需要MS/MS光谱数据，并且可以支持基于样品的归一化和基于峰的归一化。按照这个例子，研究人员可以以易于处理的方式进行代谢组学鉴定和定量。使用此管道需要 R 编程功能。为了帮助没有任何编程知识的研究人员，我们还开发了一个用于代谢组学分析的云分析平台。我们在 补充材料 5 中演示了此云分析平台。
Protocol
Representative Results
Discussion
罗斯福对非靶向代谢物的控制一直是一个巨大的挑战。在这里，我们展示了一个完整的大规模非靶向代谢组学分析（定性和定量）管道，具有罗斯福控制。这有效地减少了在MS分析中非常常见的误报。
为您的研究准备适当的参考光谱库是一个关键点。成功且灵敏的MS/MS识别不仅需要适当的匹配算法，还需要适当的参考光谱库。由于以下原因，公共光谱库的适用性受到限制：（1…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究由国家重点研发计划（2018YFC0910200/2017YFA0505001）和广东省重点研发计划（2019B020226001）支持。
Materials
| GNPS | open source | n/a | https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp |
| XY-Meta | open source | n/a | https://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta |
| metaX | open source | n/a | https://github.com/wenbostar/metaX |
| ProteoWizard | Free Download | 3.0.22116.18c918b-x86_64 | https://proteowizard.sourceforge.io/download.html |
| CHI.Client | Free Download | ndp48-x86-x64-allos-enu | http://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt |
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