마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성
Summary
우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.
Abstract
마이크로패턴 견인 현미경 검사는 단일 세포 및 세포 클러스터의 모양을 제어할 수 있게 해줍니다. 또한, 마이크로미터 길이 스케일로 패턴화하는 능력은 각 마이크로패턴화된 도트가 부드럽고 근본적인 하이드로겔을 변형시키는 단일 초점 접착의 형성을 허용하기 때문에 견인력의 측정을 위해 이러한 패턴화된 접촉 구역의 사용을 허용한다. 이러한 접근법은 내피 세포, 평활근 세포, 섬유아세포, 혈소판 및 상피 세포를 포함하는 광범위한 세포 유형에 사용되어 왔다.
이 리뷰는 미리 지정된 크기와 간격의 점들의 규칙적인 배열에서 폴리아크릴아미드 하이드로젤 상에 세포외 매트릭스 단백질을 인쇄할 수 있게 하는 기술의 진화를 설명한다. 마이크로 미터 크기의 패턴은 부드러운 기판에 직접 인쇄하기가 어렵 기 때문에 단단한 유리 커버 슬립에서 패턴이 먼저 생성 된 다음 겔화 중에 패턴을 하이드로 겔로 전달하는 데 사용됩니다. 먼저, 커버슬립 상에 작은 점들의 어레이를 생성하기 위한 원래의 마이크로컨택트 인쇄 접근법이 설명된다. 작은 점의 섬을 떠나기 위해 대부분의 패턴을 제거하는 두 번째 단계는 패턴화 된 점의 배열에서 셀과 셀 클러스터의 모양을 제어해야합니다.
다음으로, 단일 감산 패터닝 단계를 사용하여 점들의 섬들을 생성할 수 있게 하는 이러한 접근법의 진화가 설명된다. 이 접근법은 사용자를 위해 크게 단순화되었지만 패턴을 만드는 데 필요한 마스터 몰드의 수명이 감소하는 단점이 있습니다. 마지막으로, 변위된 점들의 이미지 분석과 후속 세포 생성 견인 필드의 분석을 위해 개발된 계산 접근법이 설명되고, 이러한 분석 패키지의 업데이트된 버전이 제공된다.
Introduction
대부분의 세포 표현형은 환경에 견인력을 발휘합니다. 이러한 견인력은 액틴과 미오신의 네트워크인 세포의 수축성 세포골격, 그리고 다른 필라멘트성 바이오폴리머 및 가교결합 단백질1,2,3,4에 의해 생성된다. 세포 내에서 생성된 힘은 주로 인테그린 및 카데린과 같은 막횡단 단백질을 통해 세포외 환경 또는 인접한 세포로 전달될 수 있으며, 각각 5,6. 세포가 어떻게 퍼지거나 수축하는지, 그리고 그 움직임과 관련된 견인력의 크기는 환경과의 친밀한 대화의 결과이며, 이는 주로 세포외 기질 (ECM)7,8에 존재하는 단백질의 유형과 양 및 ECM의 강성에 달려 있습니다. 실제로, 견인력 현미경 검사는 기질 강성, 부과 된 기계적 스트레스 및 균주 또는 다른 세포와의 접촉과 같은 국소 자극에 대한 세포 반응성을 이해하는 데 귀중한 도구가되었습니다. 이 정보는 암 및 천식 9,10,11,12와 같은 질병의 이해와 직접 관련이 있습니다.
견인력을 계산하기 위해 알려진 재료 특성의 기판의 힘 유도 변형을 측정하는 데 사용할 수있는 시스템이 필요합니다. 이러한 변경 사항은 시간이 지남에 따라 추적되어야 하며 이미징 및 이미지 처리 기술이 모두 필요합니다. 세포 견인력을 결정하는 데 사용 된 첫 번째 방법 중 하나는 세포와 함께 시드 된 콜라겐 하이드로 젤의 수축을 관찰하고 분석하는 것이었지만이 방법은 반 정량적인 13 개에 불과했습니다. 또 다른, 보다 정제된 방법은 실리콘14의 얇은 시트의 변형으로부터 기인하는 힘을 결정함으로써 단일 세포에 의해 가해지는 견인력을 측정하는 것이었다. 나중에보다 정량적 인 측정 기술이 개발되었으며, 이러한 방법은 폴리 아크릴 아미드 (PAA) 12,15,16과 같은 연질 하이드로 젤의 사용을 허용했습니다. 이러한 연질 재료를 사용할 때, 견인력은 하이드로겔에 매립된 랜덤하게 변위된 비드의 힘-유도된 변위 및 겔(16,17)의 기계적 특성으로부터 결정될 수 있었다. 또 다른 발전은 연질 폴리디메틸실록산 (PDMS)으로 만들어진 마이크로 포스트 어레이의 개발과 함께 이루어졌으며, 그래서 그들의 편향이 측정되고 빔 이론(18)을 사용하여 힘으로 변환 될 수있었습니다.
마지막으로, 소프트 하이드로젤을 마이크로패터닝하는 방법은 이러한 접근법이 세포 부착을 위한 접촉 영역의 제어를 허용함에 따라 개발되었다. 세포의 접촉 영역 내에서 마이크로패턴의 변형을 측정함으로써, 무힘 기준 이미지(19)가 요구되지 않기 때문에 견인력을 쉽게 계산할 수 있었다. 이 방법은 세포 견인력(20)의 측정을 위해 PAA 겔 상으로의 미크론 크기의 분리된 형광 단백질 부착 포인트의 규칙적인 어레이의 간접 패터닝을 허용하기 때문에 널리 채택되고 있다. 이러한 힘을 계산하기 위해, 사용자 입력을 요구하지 않고 각 마이크로 패턴화된 점의 움직임을 추적할 수 있는 이미지 처리 알고리즘(21)이 개발되었다.
이 방법은 도트 패턴의 전체 격자를 만드는 데는 간단하지만 도트의 격리 된 패치 (또는 섬) 패턴이 필요한 경우 더 복잡합니다. 마이크로 패턴화 된 섬은 세포 군집의 모양과 어느 정도의 크기 조절이 필요할 때 유용합니다. 이러한 섬을 만들기 위해 앞서 언급한 마이크로 접촉 인쇄 방법은 두 가지 별개의 단계를 필요로 합니다: i) 하나의 PDMS 스탬프를 사용하여 커버슬립에 점들의 고충실도 패턴을 생성한 다음, ii) 두 번째 다른 PDMS 스탬프를 사용하여 대부분의 점들을 제거하여 점들(21)의 고립된 섬들을 남겨 둡니다. 이 독창적 인 방법으로 섬을 만드는 어려움은 프로세스의 첫 번째 단계에서 일관된 그리드 패턴을 만드는 것이 그 자체로 어렵다는 사실에 의해 더욱 복잡해집니다. 마이크로 프린팅 스탬프는 원형 마이크로 포스트 배열로 구성되며, 직경은 원하는 도트 크기에 해당합니다. 그런 다음이 스탬프는 균일 한 단백질 층으로 코팅 된 다음 처리 된 커버 슬립에 정확한 양의 압력으로 스탬프되어 원하는 패턴을 만듭니다. 한편으로 스탬프에 너무 많은 압력을 가하면 기둥 좌굴 또는 기둥 사이의 처짐으로 인해 단백질 전달이 고르지 않고 패턴 충실도가 저하되어 유리와의 접촉이 발생할 수 있습니다. 반면에 너무 적은 압력을 가하면 단백질 전달이 거의 또는 전혀 이루어지지 않고 패턴 충실도가 떨어집니다. 이러한 이유로, 단 한 단계만으로 도트의 고립된 섬들의 고품질 마이크로패턴을 일관되게 생성하는 데 사용될 수 있는 전달 공정이 요구된다.
본원에서, 미크론 크기의 형광 단백질 부착 포인트가 PAA 겔 상으로의 점들의 간접적인 마이크로패터닝에 대해 기술되어 있으며, 이는 이전에 개발된 방법들보다 더 일관되고 다재다능하다. 오래된 간접 마이크로 패터닝 방법은 PDMS 스탬프에서 중간 기질로의 단백질 패턴 전달에 의존하는 반면, 여기에 도입 된 방법은 추가가 아닌 단백질 제거를위한 용기로 PDMS 스탬프를 사용합니다. 이것은 먼저 사용 된 PDMS 스탬프의 구조를 근본적으로 변경함으로써 수행됩니다. 균등하게 이격 된 원형 기둥의 패턴으로 구성된 우표를 만드는 대신,이 방법에서 균등하게 간격을 둔 원형 구멍의 패턴으로 구성됩니다.
이 새로운 구조로, 이러한 PDMS 스탬프의 표면은 이전에 기술된 바와 같이 글루타르알데히드로 처리될 수 있고, 20,29,30, 스탬프가 단백질과 공유적으로 결합할 수 있게 한다. 형광 단백질로 고르게 코팅된 유리 커버슬립에 사용될 때, 이러한 글루타르알데히드 처리된 PDMS 스탬프는 커버슬립의 표면에서 대부분의 단백질을 제거하기 위해 사용되며, 스탬프 상의 미크론 크기의 구멍의 위치에 의해 미리 결정된 원하는 도트 패턴만을 남긴다. 이러한 변화는 거의 연속적인 점 격자로 구성된 패턴을 생성하고 단 한 단계만 통해 격리된 도트 섬을 만드는 성공률을 높입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PAA 하이드로젤을 간접적으로 패터닝하는 개선된 방법이 본 논문에 기재되어 있다. 이 접근법은 20,35,36,37,38,39,40,41,42 이전에 사용 된 메소드를 기반으로합니다. 주요 변?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 데이터 분석에 대한 유용한 토론과 도움을 주신 Boston University Department of Mechanical Engineering의 Paul Barbone 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NSF 보조금 CMMI-1910401에 의해 지원되었습니다.
Materials
| (3-aminopropyl)trimethoxysilane | Sigma Aldrich | #281778 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask | Advance Reproductions Corporation | N/A | Custom-designed mask |
| 6 Well Plates | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| Acetone | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| Acrylamide Solution, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| Aminonium Persulfate | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| Bisacrylamide | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| Ethanol | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
| Glass Coverslips, 25 mm round | Fisher Scientifc | #12-545-102 | |
| Glass Coverslips, 30 mm round | Warner | #64-1499 | |
| Hamamatsu ORCA-R2 Camera | Hamamatsu | #C10600-10B | |
| Human Plasma | Valley Biomedical | #HP1051P | Used to isolate fibronectin |
| Hydrochloric Acid, 1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
| ImageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
| Interchangeable Coverslip Dish Set | Bioptechs | #190310-35 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
| Mask Alinger | Karl Suss | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
| N-hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
| Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope | Olympus | #IX81 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
| Photoresist Spinner Hood | Headway Research | #PWM32 | |
| Plasma Cleaner | Harrick | #PDC-001 | |
| Plasma Etcher | TePla | #M4L | |
| Prior Lumen 200Pro Light Source | Prior Scientific | #L200 | |
| Silicon Wafers, 100 mm | University Wafer | #809 | |
| SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9463827 | |
| SU-8 Developer | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9901158 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Essex Brownell | #DC-184-1.1 | |
| Tetramethylethylenediamine | Fisher Scientific | #BP150-20 | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | #448931 | |
| UAPON-40XW340 Objective | Olympus | #N2709300 | |
| UV Flood Exposure | Newport | #69910 | |
| Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
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