Génération de motifs pour la microscopie de traction à micromotifs

Summary

Nous décrivons les améliorations apportées à une méthode standard de mesure des forces de traction cellulaire, basée sur l’impression par microcontact avec une seule étape de motif soustractif de réseaux de points de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels mous. Cette méthode permet une fabrication plus simple et plus cohérente de motifs d’îlots, essentiels pour contrôler la forme des amas de cellules.

Abstract

La microscopie de traction à micromotifs permet de contrôler la forme des cellules individuelles et des amas de cellules. En outre, la capacité de modeler à l’échelle de longueur micrométrique permet l’utilisation de ces zones de contact à motifs pour la mesure des forces de traction, car chaque point micromotif permet la formation d’une seule adhérence focale qui déforme ensuite l’hydrogel sous-jacent mou. Cette approche a été utilisée pour un large éventail de types de cellules, y compris les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les fibroblastes, les plaquettes et les cellules épithéliales.

Cette revue décrit l’évolution des techniques qui permettent l’impression de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels de polyacrylamide dans un tableau régulier de points de taille et d’espacement prédéfinis. Comme les motifs à l’échelle micrométrique sont difficiles à imprimer directement sur des substrats souples, les motifs sont d’abord générés sur des couvercles en verre rigide qui sont ensuite utilisés pour transférer le motif à l’hydrogel pendant la gélification. Tout d’abord, l’approche originale d’impression par microcontact pour générer des tableaux de petits points sur le couvercle est décrite. Une deuxième étape qui supprime la majeure partie du motif pour laisser des îlots de petits points est nécessaire pour contrôler les formes des cellules et des amas de cellules sur de tels tableaux de points à motifs.

Ensuite, une évolution de cette approche qui permet la génération d’îlots de points à l’aide d’une seule étape de motif soustractif est décrite. Cette approche est grandement simplifiée pour l’utilisateur mais présente l’inconvénient d’une durée de vie réduite pour le moule maître nécessaire à la fabrication des motifs. Enfin, les approches informatiques qui ont été développées pour l’analyse des images de points déplacés et des champs de traction générés par des cellules ultérieures sont décrites, et des versions mises à jour de ces packages d’analyse sont fournies.

Introduction

La plupart des phénotypes cellulaires exercent des forces de traction sur leur environnement. Ces forces de traction sont générées par le cytosquelette contractile d’une cellule, qui est un réseau d’actine et de myosine, et d’autres biopolymères filamenteux et protéines de réticulation 1,2,3,4. Les forces générées à l’intérieur de la cellule peuvent être transmises à l’environnement extracellulaire ou aux cellules adjacentes, principalement via des protéines transmembranaires telles que les intégrines et les cadhérines, respectivement ^5,6. La façon dont une cellule se propage ou se contracte – et l’ampleur des forces de traction associées à ces mouvements – est le résultat d’une conversation intime avec son environnement, qui dépend en grande partie du type et de la quantité de protéines présentes dans la matrice extracellulaire (ECM)^7,8 et de la rigidité de l’ECM. En effet, la microscopie à force de traction est devenue un outil inestimable pour comprendre la réactivité cellulaire aux stimuli locaux tels que la rigidité du substrat, les contraintes et déformations mécaniques imposées, ou le contact avec d’autres cellules. Cette information est directement pertinente pour la compréhension de maladies telles que le cancer et l’asthme 9,10,11,12.

Un système pouvant être utilisé pour mesurer la déformation induite par la force d’un substrat aux propriétés connues d’un matériau est nécessaire pour calculer les forces de traction. Ces changements doivent être suivis au fil du temps, ce qui nécessite à la fois des techniques d’imagerie et de traitement d’image. L’une des premières méthodes utilisées pour déterminer les forces de traction cellulaire a été l’observation et l’analyse de la contraction des hydrogels de collagène ensemencés avec des cellules, bien que cette méthode n’ait été que semi-quantitative¹³. Une autre méthode, plus raffinée, consistait à mesurer les forces de traction exercées par des cellules individuelles en déterminant les forces résultant de la déformation d’une fine feuille de silicone¹⁴. Plus tard, des techniques de mesure plus quantitatives ont été développées, et ces méthodes ont également permis l’utilisation d’hydrogels mous tels que le polyacrylamide (PAA)12,15,16. Lors de l’utilisation de ces matériaux mous, les forces de traction ont pu être déterminées à partir du déplacement induit par la force des billes déplacées aléatoirement incorporées dans l’hydrogel et des propriétés mécaniques du gel^16,17. Une autre avancée est venue avec le développement de réseaux de micropostes en polydiméthylsiloxane mou (PDMS) afin que leur déviation puisse être mesurée et convertie en force en utilisant la théorie du faisceau¹⁸.

Enfin, des méthodes de micromotifs d’hydrogels mous ont été développées car ces approches permettent de contrôler les zones de contact pour l’adhésion cellulaire. En mesurant la déformation du micromotif dans la zone de contact d’une cellule, les forces de traction pourraient facilement être calculées car une image de référence sans force n’est pas nécessaire¹⁹. Cette méthode a été largement adoptée car elle permet la modélisation indirecte d’un réseau régulier de points d’adhésion de protéines fluorescentes discrètes de la taille d’un micron sur des gels PAA pour la mesure des forces de traction cellulaire²⁰. Pour calculer ces forces, un algorithme de traitement d’image, qui permet de suivre les mouvements de chaque point micromotif sans nécessiter l’intervention de l’utilisateur, a été développé²¹.

Bien que cette méthode soit simple pour créer des grilles entières de motifs de points, elle est plus compliquée lorsque des motifs de taches isolées (ou d’îlots) de points sont souhaités. Les îlots à micromotifs sont utiles lorsque le contrôle de la forme et, dans une certaine mesure, de la taille des amas de cellules est nécessaire. Pour créer ces îlots, la méthode d’impression par microcontact susmentionnée nécessite deux étapes distinctes : i) l’utilisation d’un tampon PDMS pour créer un motif haute fidélité de points sur un couvercle, puis ii) l’utilisation d’un deuxième tampon PDMS différent pour enlever la plupart de ces points, laissant derrière eux des îlots isolés de points²¹. La difficulté de créer des îlots avec cette méthode originale est aggravée par le fait que la création de modèles de grille cohérents dans la première étape du processus est difficile en soi. Les timbres de micro-impression sont composés d’un ensemble de micro-poteaux circulaires, dont le diamètre correspond à la taille de point souhaitée. Ces tampons sont ensuite recouverts d’une couche uniforme de protéines, puis estampés avec une pression précise sur les couvercles traités pour créer le motif souhaité. D’une part, l’application d’une pression excessive sur le tampon peut entraîner un transfert de protéines inégal et une mauvaise fidélité du motif en raison du flambement des piliers ou de l’affaissement entre les piliers, entraînant un contact avec le verre. D’autre part, l’application de trop peu de pression entraîne peu ou pas de transfert de protéines et une mauvaise fidélité du modèle. Pour ces raisons, un processus de transfert pouvant être utilisé pour créer de manière cohérente des micromotifs de haute qualité d’îlots de points isolés en une seule étape est souhaité.

Ici, une méthode est décrite pour le micromotif indirect d’îlots de points d’adhésion de protéines fluorescentes de taille micronique sur un gel PAA qui est plus cohérent et polyvalent que les méthodes précédemment développées. Alors que les anciennes méthodes de micromodélisme indirect reposent sur le transfert de motifs protéiques d’un tampon PDMS à un substrat intermédiaire, la méthode présentée ici utilise plutôt des tampons PDMS comme récipient pour l’élimination des protéines, et non pour l’addition. Cela se fait d’abord en changeant fondamentalement la structure des timbres PDMS utilisés. Plutôt que de fabriquer des timbres composés d’un motif de piliers circulaires uniformément espacés, les timbres sont constitués d’un motif de trous circulaires uniformément espacés dans cette méthode.

Avec cette nouvelle structure, la surface de ces tampons PDMS peut ensuite être traitée avec du glutaraldéhyde comme décrit précédemment 20,29,30, ce qui rend le tampon capable de se lier de manière covalente avec la protéine. Lorsqu’ils sont utilisés sur un couvercle en verre recouvert uniformément de protéines fluorescentes, ces tampons PDMS traités au glutaraldéhyde sont utilisés pour éliminer la majeure partie de la protéine à la surface du couvercle, ne laissant derrière eux que le motif souhaité de points prédéterminé par l’emplacement des trous de la taille d’un micron sur le tampon. Ce changement augmente le taux de réussite pour générer des modèles constitués d’une grille de points presque continue et pour créer des îlots isolés de points en une seule étape.

Protocol

1. Création de masters en silicone REMARQUE: La majeure partie du processus de conception, de création et de dépannage des maîtres de silicium pour le moulage répété des tampons PDMS a été couverte précédemment21, de sorte que seules les principales différences de cette nouvelle approche seront décrites ici. Créez la conception du photomasque à l’aide d’AutoCAD ou d’un logiciel de conception similaire. Enduisez un côté d…

Representative Results

Des hydrogels PAA avec le module de Young de E = 3,6 kPa et le rapport de Poisson de ν = 0,445 ont été fabriqués pour être utilisés par cette méthode de micromotif soustractif. Les hydrogels ont été conçus pour avoir une épaisseur d’environ 100 μm, ce qui leur permet d’être imagés avec la configuration d’imagerie utilisée ici tout en empêchant les cellules de détecter le couvercle rigide sous le gel, ce qui poserait des problèmes dans les études axées sur la détection de rigid…

Discussion

Une méthode améliorée de modelage indirect des hydrogels PAA est décrite dans cet article. Cette approche s’appuie sur des méthodes qui ont été utilisées précédemment 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Le principal ch…

Materials

(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40