Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Summary

Wir beschreiben Verbesserungen an einer Standardmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte, die auf dem Mikrokontaktdruck mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt von Punktarrays extrazellulärer Matrixproteine auf weichen Hydrogelen basiert. Diese Methode ermöglicht eine einfachere und konsistentere Herstellung von Inselmustern, die für die Steuerung der Zellgruppenform unerlässlich sind.

Abstract

Die Mikromuster-Traktionsmikroskopie ermöglicht die Kontrolle der Form einzelner Zellen und Zellcluster. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, auf der Mikrometerlängenskala zu mustern, die Verwendung dieser strukturierten Kontaktzonen für die Messung von Zugkräften, da jeder mikrostrukturierte Punkt die Bildung einer einzigen fokalen Adhäsion ermöglicht, die dann das weiche, darunter liegende Hydrogel verformt. Dieser Ansatz wurde für eine Vielzahl von Zelltypen verwendet, darunter Endothelzellen, glatte Muskelzellen, Fibroblasten, Blutplättchen und Epithelzellen.

Dieser Review beschreibt die Entwicklung von Techniken, die das Drucken von extrazellulären Matrixproteinen auf Polyacrylamid-Hydrogele in einer regelmäßigen Anordnung von Punkten mit vorgegebener Größe und Abstand ermöglichen. Da Muster im Mikrometermaßstab schwer direkt auf weiche Substrate gedruckt werden können, werden Muster zunächst auf starren Glasabdeckungen erzeugt, die dann verwendet werden, um das Muster während der Gelierung auf das Hydrogel zu übertragen. Zunächst wird der ursprüngliche Mikrokontaktdruckansatz zur Erzeugung von Arrays kleiner Punkte auf dem Deckglas beschrieben. Ein zweiter Schritt, der den größten Teil des Musters entfernt, um Inseln aus kleinen Punkten zu hinterlassen, ist erforderlich, um die Formen von Zellen und Zellclustern auf solchen Arrays von gemusterten Punkten zu kontrollieren.

Als nächstes wird eine Weiterentwicklung dieses Ansatzes beschrieben, die die Erzeugung von Punktinseln mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt ermöglicht. Dieser Ansatz ist für den Benutzer stark vereinfacht, hat aber den Nachteil, dass die Lebensdauer der Masterform, die zur Herstellung der Muster benötigt wird, verringert wird. Schließlich werden die Berechnungsansätze beschrieben, die für die Analyse von Bildern verschobener Punkte und nachfolgender zellgenerierter Traktionsfelder entwickelt wurden, und aktualisierte Versionen dieser Analysepakete werden bereitgestellt.

Introduction

Die meisten Zellphänotypen üben Zugkräfte auf ihre Umgebung aus. Diese Zugkräfte werden durch das kontraktile Zytoskelett einer Zelle erzeugt, das ein Netzwerk aus Aktin und Myosin ist, und anderen filamentösen Biopolymeren und Vernetzungsproteinen 1,2,3,4. Kräfte, die innerhalb der Zelle erzeugt werden, können auf die extrazelluläre Umgebung oder benachbarte Zellen übertragen werden, hauptsächlich über Transmembranproteine wie^{Integrine bzw. Cadherine 5,6}. Wie sich eine Zelle ausbreitet oder zusammenzieht – und die ^{Größenordnungen} der Zugkräfte, die mit diesen Bewegungen verbunden sind – ist das Ergebnis eines intimen Gesprächs mit ihrer Umgebung, das weitgehend von der Art und Menge des in der extrazellulären Matrix (ECM) vorhandenen Proteins ^abhängt7,8 und der Steifigkeit des ECM. Tatsächlich ist die Zugkraftmikroskopie zu einem unschätzbaren Werkzeug geworden, um die Reaktionsfähigkeit der Zellen auf lokale Reize wie Substratsteifigkeit, auferlegte mechanische Spannungen und Dehnungen oder den Kontakt mit anderen Zellen zu verstehen. Diese Informationen sind direkt relevant für das Verständnis von Krankheiten wie Krebs und Asthma 9,10,11,12.

Zur Berechnung der Zugkräfte ist ein System erforderlich, mit dem die kraftinduzierte Verformung eines Substrats mit bekannten Materialeigenschaften gemessen werden kann. Diese Veränderungen müssen im Laufe der Zeit verfolgt werden, was sowohl bildgebende als auch Bildverarbeitungstechniken erfordert. Eine der ersten Methoden zur Bestimmung der zellulären Zugkräfte war die Beobachtung und Analyse der Kontraktion von Kollagenhydrogelen, die mit Zellen ausgesät waren, obwohl diese Methode nur semiquantitativ^{war 13}. Eine weitere, verfeinerte Methode bestand darin, die von einzelnen Zellen ausgeübten Zugkräfte zu messen, indem die Kräfte bestimmt wurden, die sich aus der Verformung einer dünnen Silikonschicht¹⁴ ergaben. Später wurden quantitativere Messtechniken entwickelt, die auch die Verwendung von weichen Hydrogelen wie Polyacrylamid (PAA) ^12,15,16 ermöglichten. Bei der Verwendung dieser weichen Materialien konnten Zugkräfte aus der kraftinduzierten Verschiebung von zufällig verschobenen Perlen, die in das Hydrogel eingebettet sind, und den mechanischen Eigenschaften des Gels^16,17 bestimmt werden. Ein weiterer Fortschritt kam mit der Entwicklung von Mikropost-Arrays aus weichem Polydimethylsiloxan (PDMS), so dass ihre Auslenkung gemessen und mit Hilfe der Strahltheorie¹⁸ in Kraft umgewandelt werden konnte.

Schließlich wurden Methoden zur Mikrostrukturierung weicher Hydrogele entwickelt, da diese Ansätze die Kontrolle der Kontaktbereiche für die Zelladhäsion ermöglichen. Durch die Messung der Verformung des Mikromusters innerhalb der Kontaktfläche einer Zelle könnten Zugkräfte leicht berechnet werden, da kein kraftfreies Referenzbild erforderlich^{ist 19}. Diese Methode ist weit verbreitet, da sie die indirekte Strukturierung einer regelmäßigen Anordnung von mikrometergroßen, diskreten fluoreszierenden Proteinadhäsionspunkten auf PAA-Gele zur Messung der zellulären Zugkräfte^{ermöglicht 20}. Um diese Kräfte zu berechnen, wurde ein Bildverarbeitungsalgorithmus entwickelt, der die Bewegungen jedes mikrostrukturierten Punktes verfolgen kann, ohne dass Benutzereingaben erforderlich sind,²¹.

Während diese Methode zum Erstellen ganzer Raster von Punktmustern einfach ist, ist sie komplizierter, wenn Muster von isolierten Flecken (oder Inseln) von Punkten gewünscht werden. Mikrostrukturierte Inseln sind nützlich, wenn die Kontrolle der Form und bis zu einem gewissen Grad der Größe von Zellclustern erforderlich ist. Um diese Inseln zu erstellen, erfordert die oben genannte Methode des Mikrokontaktdrucks zwei verschiedene Schritte: i) Verwendung eines PDMS-Stempels, um ein High-Fidelity-Muster von Punkten auf einem Deckglas zu erstellen, und dann ii) Verwendung eines zweiten anderen PDMS-Stempels, um die meisten dieser Punkte zu entfernen, wobei isolierte Inseln von Punkten²¹ zurückbleiben. Die Schwierigkeit, Inseln mit dieser ursprünglichen Methode zu erstellen, wird durch die Tatsache verstärkt, dass die Erstellung konsistenter Rastermuster im ersten Schritt des Prozesses für sich genommen eine Herausforderung darstellt. Mikrodruckstempel bestehen aus einer Anordnung von kreisförmigen Mikropfosten, deren Durchmesser der gewünschten Punktgröße entspricht. Diese Stempel werden dann mit einer gleichmäßigen Proteinschicht überzogen und dann mit einer genauen Menge Druck auf behandelte Deckgläser gestanzt, um das gewünschte Muster zu erzeugen. Auf der einen Seite kann zu viel Druck auf den Stempel zu einem ungleichmäßigen Proteintransfer und einer schlechten Mustertreue führen, da die Säule zwischen den Säulen knickt oder durchhängt, was zu einem Kontakt mit dem Glas führt. Auf der anderen Seite führt die Anwendung von zu wenig Druck zu wenig bis gar keinem Proteintransfer und einer schlechten Mustertreue. Aus diesen Gründen ist ein Transferverfahren erwünscht, mit dem sich in nur einem Schritt konsistent hochwertige Mikromuster isolierter Punktinseln erzeugen lassen.

Hierin wird ein Verfahren zur indirekten Mikrostrukturierung von Inseln mikrometergroßer fluoreszierender Proteinadhäsionspunkte auf einem PAA-Gel beschrieben, das konsistenter und vielseitiger ist als zuvor entwickelte Verfahren. Während ältere indirekte Mikrostrukturierungsverfahren auf der Übertragung von Proteinmustern von einem PDMS-Stempel auf ein Zwischensubstrat beruhen, verwendet die hier vorgestellte Methode PDMS-Stempel stattdessen als Gefäß für die Proteinentfernung, nicht für die Addition. Dies geschieht, indem zunächst die Struktur der verwendeten PDMS-Stempel grundlegend geändert wird. Anstatt Stempel herzustellen, die aus einem Muster von gleichmäßig verteilten kreisförmigen Säulen bestehen, bestehen Stempel bei dieser Methode aus einem Muster von gleichmäßig verteilten kreisförmigen Löchern.

Mit dieser neuen Struktur kann die Oberfläche dieser PDMS-Stempel dann mit Glutaraldehyd behandelt werden, wie zuvor^{beschrieben 20,29,30}, wodurch der Stempel kovalent mit Protein binden kann. Wenn sie auf einem Glasdeckglas verwendet werden, das gleichmäßig mit fluoreszierendem Protein beschichtet ist, werden diese mit Glutaraldehyd behandelten PDMS-Stempel verwendet, um den größten Teil des Proteins auf der Oberfläche des Deckglases zu entfernen, wobei nur das gewünschte Muster von Punkten zurückbleibt, die durch die Position von mikrometergroßen Löchern auf dem Stempel vorgegeben sind. Diese Änderung erhöht die Erfolgsquote für die Erzeugung von Mustern, die aus einem nahezu kontinuierlichen Gitter von Punkten bestehen, und für die Erstellung isolierter Inseln von Punkten durch nur einen Schritt.

Protocol

1. Erstellung von Silikon-Mastern HINWEIS: Der größte Teil des Prozesses des Designs, der Erstellung und der Fehlerbehebung von Silizium-Mastern für das wiederholte Formen von PDMS-Stempeln wurde zuvorbehandelt 21, so dass hier nur die wichtigsten Unterschiede in diesem neuen Ansatz beschrieben werden. Erstellen Sie den Entwurf für die Fotomaske mit AutoCAD oder einer ähnlichen Konstruktionssoftware. Beschichten Sie eine Seite der Fotomas…

Representative Results

PAA-Hydrogele mit dem Young-Modul von E = 3,6 kPa und dem Poisson-Verhältnis von ν = 0,445 wurden für die Verwendung durch diese subtraktive Mikrostrukturierungsmethode hergestellt. Die Hydrogele wurden mit einer Dicke von ~ 100 μm hergestellt, wodurch sie mit dem hier verwendeten Bildgebungsaufbau abgebildet werden können und gleichzeitig verhindern, dass die Zellen das starre Deckglas unter dem Gel erfassen, was in Studien, die sich auf die Erfassung der zellulären Steifigkeit konzentrierten<sup…

Discussion

Eine verbesserte Methode zur indirekten Strukturierung von PAA-Hydrogelen wird in diesem Artikel beschrieben. Dieser Ansatz baut auf Methoden auf, die zuvor verwendet wurden 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Die Hauptänderung b…

Materials

(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40